文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的从富含多酚和多糖的泰山白花丹参根中分离出高质量RNA。方法比较了5种RNA提取方法，获得了一种以CTAB法为基础的分离高质量完整RNA的简便、快速方法。结果使用该方法从泰山白花丹参根部分离的RNA的纯度是：A260/A280为1.87，A260/A230为2.11，产量为284.62μg/g。FW 的根，电泳条带清晰，RNA完整性好。由此法所得的RNA可直接用于cDNA文库构建等分子生物学实验。结论该技术可有效地从富含多酚和多糖的泰山白花丹参根中分离出高质量RNA，为对该山东特有药材进行分子生物学研究奠定基础。
       【关键词】  泰山白花丹参； 根； RNA提取
       Isolation of High Quality Total RNA from Root of Taishan Salvia miltiorrhiza Bge. f.alba and DDRT-PCR Test
       WANG Jianmei, SHI Renjiu, MIAO Miao, LI Yanling, HAO Gangping*
       (Department of Biological Science, Taishan Medical College , Taian 271016, China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the high quality total RNA isolation method from root of Taishan Salvia miltiorrhiza Bge. f.alba C. Y. WU et H.W. Li containing much polyphenols and amylose.MethodsSimple and rapid procedure for high-quality total RNA isolation modified from CTAB based method was obtained by comparing five RNA isolation methods. ResultsA260/A280 and A260/A230 of prepared RNA were respectively 1.87 and 2.11,  and RNA amount were 284.62μg/g fresh weight of root. The results of electrophoresis showed that RNA bands were clear and showed no degradation. This high quality RNA could meet the demands of molecular analysis, such as cDNA library construction.ConclusionThis modified technique based on CTAB method may be efficient and reliable in isolating high quality RNA from Taishan Salvia miltiorrhiza Bge. f.alba C. Y. WU et H.W. Li containing much polyphenols and amylase. This study established the base for further study of this medicinal plant found only in Shandong province.
       Key words：Taishan Salvia miltiorrhiza Bge. f.alba C. Y. WU et H.W. Li；  Roots;  RNA isolation 
       
       丹参(Salvia miltiorrhiza)是我国传统中药, 具有活血化淤、通经止痛的功能。丹参中含有二类活性成分: 脂溶性二萜醌类化合物和水溶性酚酸类化合物［1，2］。二萜醌类化合物, 如丹参酮I, 丹参酮IIA，隐丹参酮等，具有抑制血小板聚集、耐缺氧、改善冠状动脉供血等药理作用, 是治疗心血管系统疾病的重要药物；酚酸类化合物, 如丹酚酸A, 丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、原儿茶醛、丹参素等, 具有很强的抗脂质氧化、抗肝纤维化、改善尿毒症、改善肾功能等作用［1，2］。两类物质都是颇有价值的药用资源，均蕴藏着巨大的市场潜力。
       
       生长在泰山的白花丹参Salvia miltiorrhiza Bge. f.alba C. Y. WU et H.W. Li是紫花丹参的变型，系多年生草本植物。白花丹参除具丹参的生物活性和用途外，对治疗血栓性脉管炎具有独特疗效［1］。现在，白花丹参已作为一个新品种被收录进《山东省中药材标准》(2000 年版)［3］。通过实验研究，证明白花丹参与丹参的化学成分基本相同，含有脂溶性成分丹参酮类，水溶性成分酚酸类［4］。但是白花丹参中的水溶性成分明显高于紫花丹参，约为紫花丹参的2倍，这是化学成分方面较大的不同［3］，另外白花丹参中铁、镁、锰等5种微量元素也高于紫花丹参［5］。因此，白花丹参具有重要的医药和经济价值。
       
       白花丹参主要分布在山东省泰山及周边地区章丘、莱芜等地，生于山坡、林缘草丛，属珍稀濒危药用植物［6］，山东省有少量栽培，但未形成流通商品药材，为山东特产药材之一。由于丹参有效成分在原植物根中含量低、生长周期长, 加之由于近年来环境恶化和过度采挖，原本就罕见的泰山野生白花丹参濒临绝迹边缘，同时栽培产地环境污染和农药使用等原因, 使得原料药的供应在数量和质量上都不能满足临床应用的需要。而应用植物基因工程与组织细胞工程相结合的生物学方法有望成为生产这些活性药用次生代谢产物最有效的手段。同时, 丹参染色体数目少(2n= 14) , 次生代谢产物种类多(上万种) , 具有中药分子生物学研究模式物种的各种有利条件。而高质量RNA的获得是进行丹参分子生物学研究的重要基础。但是由于丹参组织中富含多糖、多酚以及各种已知或未知的次生代谢物质［7，8］, 用一般植物RNA提取方法很难从丹参中获得高质量的RNA。近年来, 关于富含多糖、多酚药用植物组织RNA 的提取已有一些报道［9～11］,但目前还没有关于野生白花丹参多年生根部RNA提取的报道。本研究在目前使用较多的几种方法的基础上对常规的提取方法进行了改进，发现改良后的CTAB法对于提取泰山野生的白花丹参根总RNA具有良好的提取效果，且步骤较简单、省时。产物经琼脂糖凝胶电泳检测, 所得RNA质量较好, 进一步采用DDRT-PCR检测分析，也表明RNA的质量可以达到DDRT-PCR分析的要求，为进行泰山野生白花丹参的分子生物学实验和保护山东特有的泰山野生白花丹参资源奠定基础。
       1  材料与方法
       1.1  材料分别取泰山野生丹参多年生根、幼茎、嫩叶, 采后于液氮中快速冷冻, -80℃ 冻存备用。
       
       异硫氰酸胍、SDS、CTAB、PVP、饱和酚（pH为4.5）、LiCl及PCR试剂均购于上海生工公司；反转录酶购自TAKARA公司；其他试剂为国产分析纯。
       
       所用试剂均以0.1% DEPC 处理水配置；塑料耗材均预先用0.1% DEPC 水于37℃ 下处理12 h，然后高压灭菌；研钵和玻璃器皿经180 ℃高温烘烤 12 h 以上，以避免 RNAase 的污染。
       1.2  RNA提取方法
       1.2.1  异硫氰酸胍方法实验操作按照陈莉等［10］报告的方法进行。
       1.2.2  Trizol试剂快速提取法试剂购自Invitrogen公司。取0.5 g预先冻存的野生泰山白花多年生丹参根和100 mg  PVP 放于装有过量液氮的研钵中充分研磨，以下实验操作按照说明书进行。
       1.2.3  CTAB法参照杜希华等［12］的方法进行。
       1.2.4  改进的异硫氰酸胍方法参照陈莉等［10］的方法，并略加改进：①取0.5 g 预先冻存的野生泰山白花多年生丹参根和100 mg PVP 放于装有过量液氮的研钵中充分研磨, 用预冷的药匙将丹参粉末转入预先装有冰冷的3 ml异硫氰酸胍缓冲液的离心管中, 剧烈振荡2 min。异硫氰酸胍缓冲液的成分为：4 mol/L 异硫氰酸胍,25 mmol/L pH 7.5的柠檬酸钠，0.5% 的十二烷基肌氨酸钠，用前加β-巯基乙醇至终浓度为2%。② 4℃，12 000 r/min离心10 min，去除沉淀，将上清液转移到另一离心管中。③在离心管中加1/10 体积 2 mol/L NaAc (pH 4. 0)，充分振荡20 s。④加入3 ml 饱和酸性酚（pH 4. 5）和1 ml 氯仿∶异戊醇（24∶1），旋涡振荡3 min，冰浴15 min。4℃ 12 000 r/min 离心10 min。⑤取上清液加入1/10体积 -20℃预冷的无水乙醇, 颠倒混匀, -20℃沉淀20 min。4℃ 12 000 r/min离心10 min。⑥取上清液加1/3 体积的 5 mol/L KAc，混匀，冰浴15 min，4℃ 12 000 r/min 离心10 min。⑦取液相加入2倍体积的 -20℃预冷的无水乙醇, -80℃静置2 h 以上。⑧4℃ 14 000 r/min离心15 min，弃上清,沉淀中加1 ml LiCl (4 M), 枪头贴壁轻轻吹打混匀, 转入1.5 ml 离心管中。⑨4℃ 14 000 r/min离心15 min，弃上清, 沉淀用0.4 ml 0.1 % DEPC 水充分溶解。⑩加入200 μl 酸酚, 振荡10 s, 200 μl 氯仿, 振荡10 s。4℃ 12 000 r/min 离心5 min, 吸出上清。○11上清中加入等体积氯仿重复抽提1次,4℃ 12 000 r/min 离心 5 min。○12取上清液加入1/10体积的3 mol/L NaAc (pH 5.2)和等体积的异丙醇，混匀，置-20℃冰箱 30 min。○134℃ 14 000 r/min 离心30 min，沉淀用70 % 的乙醇洗两遍，真空干燥。用适量DEPC水溶解沉淀，-70℃ 保存。
       1.2.5  优化的CTAB 法主要参照文献［11］的方法，并加以改进：①取0.5 g 预先冻存的野生泰山白花多年生丹参根和100 mg PVP 放于装有过量液氮的研钵中充分研磨, 用预冷的药匙将丹参粉末转入预先装有65℃的CTAB提取缓冲液(W/V=1∶5),振荡30～60 s 后，于65℃水浴中继续振荡2～5 min。CTAB提取缓冲液的成分为：2% CTAB，2% PVP，25 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，0.5 g/L 亚精胺，0.5% 皂土, 用前加β-巯基乙醇至终浓度为2%。②4℃，12 000 r/min离心10 min，去除沉淀，将上清液转移到另一离心管中。③在离心管中加1/10 体积 2 mol/L NaAc (pH 4. 0)，充分振荡20 s。④加一倍提取缓冲液体积的饱和酸性酚（pH 4.5），继续振荡混匀；再加一倍提取缓冲液体积氯仿∶异戊醇（24∶1），振荡混匀。4℃，12 000 r/min 离心10 min。⑤取上清液到一新管，加入1/2 体积的5 mol/L KAc(pH 4.8)，冰上放置10 min；4℃，12 000 r/min 离心10 min，取上清。⑥在上清液中加入等体积LiCl (8M)，混匀，冰上放置1 h。⑦4℃，14 000 r/min离心30 min, 弃上清。⑧500 μl 0.5 % SDS 溶解沉淀。⑨加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提一次。4℃，12 000 r/min 离心8 min。⑩将上清液转到新管中，加入等体积的乙二醇丁醚，冰上放置10 min。○114℃，14 000 r/min 离心15 min。去液相，沉淀用70％乙醇洗两次。干燥，溶于适量用适量DEPC水溶解沉淀。-70℃ 保存。
       1.3  RNA 完整性及纯度检测
       1.3.1  RNA 电泳分析RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在1×TAE 中进行，琼脂糖浓度为1％（每100 ml凝胶中加入2.5 μl的EB）。1～2 μl 上样量，80V 恒压40 min，然后在紫外凝胶成像系统中观察所提取RNA的完整性。
       1.3.2  RNA 纯度鉴定取1 μl样品，稀释一定倍数，紫外分光光度计测量其在230 nm，260 nm和280 nm处的紫外吸光值（A）。计算A260/A280，A260/A230用于纯度分析和浓度确定，根据浓度计算RNA的产量。
       1.4  mRNA差异显示
       1.4.1  cDNA第一链的合成RT-PCR按TaKaRa公司AMV反转录酶操作手册进行，以改进的CTAB法提取的丹参根和叶片总RNA进行反转录，合成cDNA第一链。反转录所用的锚定引物为5′-T13 C -3′，5′-T13 G-3′(上海生工生物工程技术服务公司合成)。
       1.4.2  PCR扩增及产物分离PCR扩增采用与反转录相同的锚定引物，随机引物(由上海生工生物工程技术服务公司合成)序列分别为S367(5′-AGCGAGCAAG-3′)，S379(5′-CACAGGCGGA-3′)，S486(5′-GAGCGCCTTG-3′)，S492(5′-AGTAGGGACA-3′)，S493(5′-GGAGTGGACA-3′)。PCR反应体系为25μl，反应程序为： 94℃预变性2 min，然后94℃ 变性30 s，40℃退火1 min，72℃ 延伸2 min，40个循环后72℃延伸 7 min。取5 μl PCR扩增产物，在1.8% 的琼脂糖凝胶电泳分离约2 h，照相。
       2  结果
       2.1  不同方法提取白花丹参总RNA 的质量比较首先参照陈莉等介绍的异硫氰酸胍法、杜希华等报告的CTAB法、Trizol法3种方法, 提取泰山白花丹参多年生根的总RNA，结果发现Trizol法所提取的RNA电泳时点样孔中有大量蛋白质和多糖物质, RNA 降解比较严重（见图1）, 陈莉等介绍的异硫氰酸胍法和杜希华等报告的CTAB法点样孔中虽也有大量蛋白质和多糖物质，也有部分RNA降解，但比Trizol法提取的RNA质量好（见图1）。因此, 选择对异硫氰酸胍法和CTAB法进行优化, 以期获得步骤较简单，省时和高质量的丹参RNA。
       
       改进的异硫氰酸胍法中采用低浓度的乙醇(10%～20% )、高浓度的乙酸钾(pH<5. 8, 5 mo l/L )来沉淀多糖及次生代谢物, 结果发现这些步骤确能提高RNA的质量。优化的CTAB法中加入0.5% 皂土，高浓度的乙酸钾(pH<5. 8, 5 mol/L )，并采用高浓度LiCl (8 M)后，冰上放置短时间（1 h）沉淀RNA，电泳结果发现大大提高了RNA的质量，且缩短了提取时间。
       
       我们选择了提取时间短的优化后的CTAB法进一步验证该方法对泰山白花丹参茎、叶及多年生根RNA的提取效果, 电泳结果表明RNA质量均十分良好，能看到清晰的28 S 和18 S 两条主带，5 S带也很清楚  ，但比较而言，叶片提取的RNA质量好于多年生根提取的RNA(见图2)。
       图1  不同方法提取白花丹参总RNA的琼脂糖凝胶电泳（略） 
       2.2  不同方法提取白花丹参总RNA的纯度和产量比较纯RNA溶液的A260/A280比值应介于1.7～2.0，A260/A230比值应大于2.0。不同提取方法获得的RNA的纯度和产量分析显示（见表1），异硫氰酸胍法、杜希华等报告的CTAB法、Trizol法3种方法的纯度和产量均不理想。改进的异硫氰酸胍法和优化后的CTAB法的A260/A280的比值均很好，但改进的异硫氰酸胍法提取的RNA的A260/A230的比值为1.86，显示仍有异硫氰酸胍残留。优化后的CTAB法的RNA产量也高于改进的异硫氰酸胍法，分别是306.62和201.74μg/g.FW，可能由于后者步骤繁多，导致改进的异硫氰酸胍法RNA产量较低。
       图2  优化的CTAB法提取白花丹参不同组织的总RNA（略） 
       表1  各种方法提取白花丹参RNA的纯度和产量比较（略） 
       2.3  mRNA 差别显示检测RNA的质量以优化的CTAB法提取的RNA为模板进行反转录，用5′-T13 C -3′和5′-T13 G-3′两个锚定引物分别与上述5个随机引物组合，DDRT-PCR方法比较白花丹参多年生根和叶片的mRNA扩增带型差异(见图3)。从图3可以看出，每对引物组合都可获得10～30条cDNA扩增带，cDNA条带长度主要集中在250～2 000 bp之间，并且显示差异带明显，说明这些cDNA扩增带的丰度及长度均能满足DDRT-PCR技术的要求，进一步证明优化的CTAB法提取的泰山野生白花丹参多年生根总RNA质量很好，能够满足后续分子生物学实验的要求。
       泳道1、3、5、7、9：根提取的RNA；泳道2、4、6、8、10： 叶提取的RNA；泳道M：DNA分子量标准（从上到下分子量大小：3000，2000，1500，1000，750，500，250，100 bp）；泳道1、2的锚定引物：5′-T13G-3′，随机引物：S367；泳道3、4的锚定引物：5′-T13G-3′，随机引物：S379；泳道5、6的锚定引物：5′-T13G-3′，随机引物：S492；泳道7、8的锚定引物：5′-T13C-3′，随机引物：S486；泳道9、10的锚定引物：5′-T13C-3′，随机引物：S493
       图3  白花丹参根和叶mRNA差异显示（略） 
       3  讨论
       
       分离纯净、完整的RNA对于分子克隆实验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基础。但由于不同的药用植物的次生代谢产物随种质和生长环境不同而存在较大差异，多糖、酚类物质等影响RNA提取的主要因素的种类和含量存在差异，所以一般来说,不同的植物材料必须经过摸索和实践而采取不同的RNA提取方法。
       
       本实验首先在异硫氰酸胍法的基础上, 通过酸酚变性法［13］综合NaAc选择沉淀法［14］,去除DNA 彻底, 排除了其对后继实验的干扰。多糖及次生代谢物的污染是提取植物总RNA时, 常遇到的一个棘手问题。本实验分别用低浓度乙醇、醋酸钾共同沉淀匀浆上清液中的多糖及次生代谢物，取得较好的效果。同时，采用LiCl选择性地沉淀RNA, 获得的RNA纯度也较高, 多糖去除的也较好［15］，但由于此方法步骤繁琐，需要较长时间，导致RNA产量较低。
       
       为此，我们又继续在CTAB法的基础上优化该方法。皂土具有吸附蛋白质及有效抑制Rnase 的特性［16，17］。利用这些特性，将皂土加入到RNA提取缓冲液，早期抑制及吸附样品中的Rnase 等蛋白质，从而减少了后期用酚/氯仿抽提去蛋白的次数，节省了实验时间，有利于减少RNA的降解，降低RNA的损耗。另外在沉淀之前加入1/2 体积的5 M KAc（pH 4.8），有利于去除样品中的多糖，提高样品的质量［18］；而沉淀使用乙二醇丁醚代替传统的异丙醇和无水乙醇能有效的去除样品中的多酚类物质［19］。另外我们还采用高浓度LiCl(8M)，冰上放置短时间（1 h）沉淀RNA，大大节省了提取时间。可见本研究采用优化的CTAB法提取到了高质量的泰山白花丹参多年生根总RNA，具有简单、经济、高效的特点, 提取的RNA可用于cDNA文库的构建、RT-PCR和Northern 杂交等分子生物学实验。
       【参考文献】
         　　［1］ 林 琦, 陆金国. 丹参抗动脉粥样硬化的研究进展［J］. 山西中医，2002，18(4): 56.
       
       ［2］ 郝岗平,孙立彦, 史仁玖, 等. 山东产丹参遗传多样性的AFLP指纹分析［J］. 时珍国医国药, 2007,18 (1): 51.
       
       ［3］ 马丽虹, 翟树林, 王传杰. 白花丹参的开发进展［J］. 中国林副特产，2005，20(1)：72.
       
       ［4］ 齐永秀, 曹明亮, 王晓丹, 等. 泰山野生丹参与种植丹参根、茎、叶中三种有效成分含量的分析比较［J］. 药物生物技术, 2006, 13(4): 279.
       
       ［5］ 齐永秀, 杨志孝, 李 珂,等. 白花丹参与紫花丹参微量元素分析比较［J］. 泰山医学院学报, 2004, 25(6): 589.
       
       ［6］ 周凤琴, 李建秀，张照荣. 山东珍稀濒危野生药用植物的调查研究［J］. 中草药, 1998, 9(1):46.
       
       ［7］ 郝岗平, 边高鹏, 张媛英. 泰山白花丹参干叶片高质量DNA的提取［J］. 中草药, 2006, 37(6): 855.
       
       ［8］ 郭济贤. 丹参的研究与临床应用［M］. 北京: 中国医药科技出版社, 1992:39.
       
       ［9］ 祖元刚, 王延兵, 王慧梅,等. 黄檗叶片总RNA提取方法研究［J］. 植物研究, 2005, 25(3): 2.
       
       ［10］ 陈 莉, 朱 华, 李王申, 等. 三七总RNA提取方法的对比研究［J］. 生物技术通讯, 2005, 16(5): 528.
       
       ［11］ 唐明娟, 郭顺星. 金线莲RNA提取方法的改进［J］.中草药, 2002, 33(10): 937.
       
       ［12］ 杜希华, 陆 海, 高述民,等. 文冠果花药总RNA提取方法研究［J］. 北京林业大学学报, 2003,25(1): 10.
       
       ［13］ Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction ［J］. Anal Biochem,1987,162(1):156.
       
       ［14］ 顾红雅，瞿礼嘉，明小天，等.植物基因与分子操作［M］.北京：北京大学出版社，1995：77.
       
       ［15］ Su X, Gibor A. A method for RNA isolation from marine macroalgae ［J］. Anal Biochem, 1988, 174: 650.
       
       ［16］ Zhang YP, Uyemoto JK, Kirkpatrick BC. Analysis of double-stranded RNAs from cherry trees with stem pitting in California ［J］. Plant Disease, 1998, 8(8):871.
       
       ［17］ Putzer H, Condon C, Brechemier-Baey D, Brito R, Grunberg-Manago M. Transfer RNA-mediated antitermination in vitro ［J］. Nucleic Acids Research, 2002, 30(14): 3026.
       
       ［18］ 杜中军，徐兵强，黄俊生，等. 一种改进的富含多糖的芒果组织中完整总RNA提取方法［J］. 植物生理学通讯, 2005, 41(2): 202.
       
       ［19］ 张 容, 郑彦峰, 吴 瑶,等. 一种简单有效的植物RNA提取方法［J］. 遗传,2006, 28(5):583.