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       【摘要】 
       目的研究旱莲草总黄酮的提取及其抗氧化活性。方法利用Fentaon反应产生羟自由基·OH，光照核黄素产生超氧阴离子自由基O-2·，采用分光光度法研究旱莲草体外清除活性氧自由基的作用，用硫代巴比妥酸（TBA）分光光度法研究其对·OH诱发卵磷脂脂质过氧化和DNA氧化损伤的抑制作用。结果旱莲草总黄酮得率为3.96%，对·OH、O-2·的半清除率IC50为0.015 mg·ml-1，0.08 mg·ml-1;对脂质过氧化DNA氧化损伤的半抑制率为0.02 mg·ml-1，2.0 μg·ml-1。结论旱莲草总黄酮能有效清除活性氧自由基，对卵磷脂脂质过氧化和DNA氧化损伤有显著抑制作用。　
       【关键词】  旱莲草； 总黄酮； 抗氧化
       Study on Extraction of Flavone from Eclipta alba and its Antioxidation in vitro
       WANG Xuemei, ZHANG Jiansheng, DAI Yun, GAO Yuntao*
       (School of Chemistry and Bio-Science , Yunnan Nationalities University , Kunming 650031 , China)
       Abstract：ObjectiveTo study the extraction of flavone from Eclipta alba and its antioxidation function.MethodsScavenging effects of Eclipta alba on active oxygen species ·OH and O·-2 generated by Fenton reaction and riboflavine photosensitization were investigated by the means of spectrophotometry. The inhibitory effects of Eclipta alba on the lecithin lipid peroxidation and damage of DNA chain induced by hydroxyl radical were observed by thiobarbit uric acid spectrophotometry.ResultsTotal flavonoids in Eclipta alba was 3.96%; the semi-clearance rate of ·OH and O·-2was 0.015 mg·ml-1 and 0.08 mg·ml-1; the semi-inhibition rate of Lecithin lipid peroxidation and oxidation damage of DNA was 0.02 mg·ml-1 and 2.0 μg·ml-1.ConclusionEclipta alba can scavenge active oxygen efficiently. It can also significantly inhibit lipid peroxidation and damage of DNA by hydroxyl radical.
       Key words：Eclipta alba;   Flavone;  Antioxidation
       
       旱莲草Eclipta alba是菊科植物鳢肠Ecliptaprostratal L. 的干燥地上部分。各个不同的地区有许多别名,如墨旱莲、水旱莲、墨斗草等［1］。中医用其滋补肝肾，凉血止血。现代药理研究证明墨旱莲具有止血、保肝、免疫调节、抗诱变以及抗菌抗炎等病症［2］。在傣族传统医药中，旱莲草被称为皇旧，有治疗风湿麻木、痿软偏瘫、头痛耳聋、尿路感染、各种出血、黄疸等作用。同时，旱莲草在食用方面也有较广泛的应用,有“亦蔬亦药”的说法［3］。植物中的黄酮类成分均有一定的抗氧化活性［4］，有研究报道旱莲草的黄酮类成分具有免疫调节作用［5］，但关于旱莲草黄酮类成分的抗氧化活性研究目前鲜有报道。本实验对旱莲草总黄酮的提取及其体外抗氧化活性进行了研究。
       1  器材
       
       旱莲草（购至当地中药店），核黄素（VB2），氯化硝基四氮唑兰（NBT）（购至ChemBase公司），番红花红（Safranine T），蛋氨酸，鲱鱼精DNA（购至sigma公司），2-硫代巴比妥酸（TBA），三氯乙酸（TCA），无水乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，石油醚，所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
       
       9200型紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司），数显恒温水浴锅，低温超速离心机，光照箱（自制，35 cm×30 cm×25 cm，光源为纯稀土节能灯，灯功率45 W）。
       2  方法
       2.1  旱莲草总黄酮成分的提取［6］称取旱莲草粉末12 g，用20倍量的85 %的乙醇超声浸提45 min，过滤，滤渣再用20倍量的85 %的乙醇超声浸提45 min，过滤后合并两次滤液，用石油醚萃取两次，取下层液于旋转蒸发仪浓缩至干，称重。将旱莲草总黄酮初提物用甲醇溶解并定溶至100 ml备用。
       2.2  总黄酮含量的测定准确称取芦丁标准品0.013 2 g，用70 %的乙醇溶解转移至50 ml的容量瓶(浓度为0.264 mg·ml-1)，精密量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0 ml置于25 ml比色管中,用30 %乙醇溶液补充至10 ml，加入5 %亚硝酸钠溶液0.7 ml,摇匀,放置5 min后,加入10 % 硝酸铝溶液0.7 ml，摇匀, 5 min后再加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液5 ml，摇匀，用30 %乙醇溶液稀释至刻度,10 min后在510 nm处测定吸光度,以蒸馏水为空白参比。以芦丁浓度对吸光度作标准曲线,并计算回归方程。吸取2 ml旱莲草提取液于25 ml比色管中，按上述标准曲线的操作方法测定吸光度Y值,并通过标准曲线的回归方程换算成浓度X(mg·ml-1)。
       2.3  旱莲草总黄酮清除超氧阴离子自由基活性测定采用光照核黄素［7］的方法用 0.05 mol·L-1 pH = 7.4 的PBS缓冲液为溶剂，配制1.67 ×10- 5 mol·L-1核黄素，0.01 mol·L-1 蛋氨酸，4. 6×10- 5mol·L-1氯化硝基四氮唑兰(NBT) 。分别取上述3种溶液各2.0 ml，加入不同浓度的总黄酮提取液（样品）溶液1.0 ml，空白管以1.0 ml缓冲液代替样品溶液。置于光照箱中光照30 min，取出后以缓冲溶液为参比于560 nm处测定溶液的吸光度。清除率按下式计算。A0为空白管的吸光度。A样为样品管的吸光度。
       
       清除率（%）=A0-A样A0×100%
       2.4  旱莲草总黄酮清除羟自由基活性测定采用亚铁离子催化过氧化氢产生羟自由基（Fenton反应），该反应产生的羟自由基可使番红花红褪色［8］。
       
       取0.15 mol·L-1 pH 7.4的磷酸缓冲溶液1.0 ml，40 μg·ml-1番红花红1.0 ml，0.945 mmol·L-1 EDTA-Fe(Ⅱ)（新鲜配制）1.0 ml，样品溶液0.5 ml、3 %H2O21.0 ml（新鲜配制），混合后在37℃水浴中反应30 min后在520 nm处测定吸光度As。空白组以0.5 ml蒸馏水代替样品测定吸光度A0，对照组以1.5 ml蒸馏水代替H2O2和样品测定吸光度A，用3.5 ml蒸馏水代替番红花红、EDTA-Fe(Ⅱ)、H2O2、样品，1.0 ml磷酸盐缓冲溶液，调零。并按下式计算清除率。
       
       清除率（%）=As-A0A-A0×100%
       2.5  旱莲草总黄酮对脂质过氧化抑制活性的测定［9］取0.2 ml卵磷脂溶液（用300 mg 卵磷脂溶解于30 ml 10 mmol·L-1 pH 7.4 PBS，冰浴振荡），加入 pH 7.4 PBS缓冲液1.0 ml，不同浓度的样品溶液0.5 ml，2.5 mmol·L-1 EDTA-Fe(Ⅱ) 1.0 ml，混匀后于37℃水浴中反应45 min，再加入28 %（W/V）的TCA 2.0 ml，1 %（W/V）的TBA1.0 ml，混匀后置于100℃沸水浴中加热10     min，冷却后在532 nm处测定吸光度A样，用PBS缓冲液调零，空白管用PBS缓冲液代替样品测吸光度A0。并按下式计算抑制率。
       
       抑制率（%）=A0-A样A0×100%
       2.6  ·OH引发DNA损伤抑制TBA法［10，11］取pH = 7.0 的Tris- HCl 缓冲溶液1.0 ml，4 mg·ml-1 DNA 0.2 ml，不同浓度的样品溶液0.5 ml，25 mmol·L-1 EDTA-Fe(Ⅱ) 1.0 ml，3 %H2O21.0 ml（新鲜配制），在37℃水浴中恒温1.5 h后，取出加入28 %（W/V）的TCA 2.0 ml，1 %（W/V）的TBA1.0 ml，混匀后置于100 ℃沸水中加热10 min，冷却后于波长532 nm处测吸光度A样 。空白管以0.5 ml蒸馏水代替样品测A0。用缓冲溶液作参比，抑制率按下式计算。
       
       抑制率（%）=A0-A样A0×100%
       3  结果
       3.1  旱莲草总黄酮得率计算按前述方法,测定不同浓度的标准芦丁溶液的吸光度，得到芦丁标准溶液的标准曲线，用最小二乘法进行线形回归，得到芦丁溶液浓度Y(mg·ml-1)与吸光度值X关系曲线的回归方程式：Y = 6.186 7X-0.005 2，其相关系数R2 =0. 999 2。由回归方程及样品吸光度计算出样品中黄酮的含量，计算总黄酮得率为3.96 %。
       3.2   旱莲草总黄酮对超氧自由基的清除作用在蛋氨酸存在的情况下对核黄素进行光照可产生超氧阴离子自由基，在反应体系中加入氯化硝基蓝四哇可生成蓝色物质，当反应体系中加入抗氧化剂时，与NBT反应生成的蓝色物质的量减少，因此通过反应体系的吸光度值的变化可测定此化合物的抗氧化活性。旱莲草总黄酮对超氧自由基的清除作用见图1。实验以芦丁标准品为对照。由图1可知，随着浓度的增加，清除作用也随着增大，旱莲草对O-2·产生50%清除效应所需的样品浓度为IC50= 0.08 mg·ml-1（已换算为总黄酮的质量浓度），当总黄酮质量浓度为0.18 mg·ml-1时，清除率达到87.7 %。相同条件下测得芦丁的IC50 =0.05 mg·ml-1，表明旱莲草总黄酮和芦丁对超氧自由基的清除作用比较接近。
       图1  对超氧阴离子自由基的清除作用（略）
        
       3.3  对Fenton反应产生·OH的清除作用旱莲草总黄酮对Fenton反应产生·OH的清除作用见图2。由图2可知，旱莲草总黄酮对·OH的IC50 = 0.015 mg·ml-1，当总黄酮质量浓度为0.09 mg·ml-1时，清除率达到84.1 %。相同条件下测得芦丁的IC50 =0.003 mg·ml-1，说明旱莲草总黄酮对·OH表现出很好的清除作用。
       
       图2  对Fenton反应产生·OH的清除作用（略）
       3.4  对脂质过氧化的抑制作用硫代巴比妥酸（TBA）可与丙二醛（MDA）类似物反应生成粉红色物质，该物质在532 nm处有最大光吸收，采用TBA反应可定量检测卵磷脂被氧化损伤时产生MDA的量，加入抗氧化物质可间接测出卵磷脂被氧化损伤的抑制率。旱莲草总黄酮对脂质过氧化的抑制作用见图3。由图3可知，旱莲草总黄酮对脂质过氧化的半抑制率为IC50 = 0.02 mg·ml-1，当总黄酮质量浓度为0.12 mg·ml-1时，抑制率达到73.4%，随后，抑制率趋于平稳。
       图3  对脂质过氧化的抑制作用（略）
       3.5  对·OH引发DNA损伤的抑制作用采用TBA反应可定量检测脱氧核糖或DNA上脱氧核糖环的受·OH攻击氧化断裂产生的丙二醛类似物［12］。旱莲草总黄酮对·OH引发DNA损伤的抑制作用见图4。由图4可知，加入样品后，DNA氧化损伤被抑制，抑制率随着浓度的增加而增大，旱莲草总黄酮对·OH引发DNA损伤的半抑制率为IC50=2.0 μg·ml-1，当质量浓度为3 μg·ml-1时抑制率达到87.8 %。相同条件下测得芦丁的IC50=0.1 mg·ml-1，说明旱莲草总黄酮对·OH引发DNA损伤的抑制作用优于芦丁。
       图4  对·OH引发DNA损伤的抑制作用（略）
       4  讨论
       
       旱莲草含有芹菜素( apigenin) 、木樨草素(luteolin) 、槲皮素(quercetin) 以及芹菜素-7-氧-葡萄糖苷( apigenin-7-O-glucoside) 和木樨草素-7-氧-葡萄糖苷(luteolin-7-O-glucoside) 等黄酮类化合物［13］。研究表明，含酚羟基的化合物具有明显的清除氧自由基的作用，这种清除氧自由基的能力来自于酚羟基的供氢或供电子能力［14］。本实验结果证实旱莲草中黄酮类物质有很好的清除氧自由基作用，并且能有效抑制MDA生成，具有很好的抗脂质过氧化及保护DNA免受自由基氧化损伤的能力，为旱莲草的药理研究提供一些理论上的依据。
       【参考文献】
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