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       【摘要】 
       目的优选超声波提取茯苓多糖工艺参数。方法以茯苓多糖为评价指标，采用均匀设计实验对超声波提取茯苓多糖提取工艺进行优选。结果最佳提取工艺条件为：溶剂70%的乙醇，料液比为1∶10，温度25℃，提取20 min。结论优选出的工艺科学合理。
       【关键词】  茯苓； 超声波提取； 均匀设计
       Optimization of Supersonic Extraction Conditions for Pachyman in Poriacocos(Schw.) Wolf by Uniform Design
       ZHAO Zijian, CHEN Dizhao,LIAN Yan,ZHAO Yongxin
       （Chemical Department, Huaihua College, Huaihua, 418008，China）
       Abstract：ObjectiveTo optimize the supersonic extraction process of pachyman in Poriacocos(Schw.) Wolf. MethodsThe Uniform design was used to optimize supersonic extraction process of pachyman in Poriacocos(Schw.) Wolf with the rate of pachyman in Poriacocos(Schw.) Wolf.  ResultsThe optimal extracting procedure was as follows: the extraction solvent was 40% ethanol,feed ratio was 1：10,the extraction temperature was 25℃and the extraction time was 20 min. ConclusionThe optimum extracting procedure is reasonable and stable.
       Key words：Poriacocos(Schw.) Wolf ；  Supersonic Extraction；  Uniform design
       
       茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos (Schw.) Wolf的干燥菌核，其性味甘、淡、平，归脾胃肺肾经，有利水渗湿、益脾宁心之功效。主治气虚劳伤、水肿、痰饮、呕吐、腹泻、热淋、遗精、惊悸、健忘等证。茯苓多糖是茯苓的有效部位之一，为灰白色粉末，味微咸，无臭，略有吸湿性。具有抗肿瘤、提高机体免疫力、保肝与催眠、抗衰老、抗单纯疱疹病毒、防石、消石、抗炎等作用［1］。为了更好地利用茯苓，提高茯苓多糖的收率，本研究采用了均匀设计法进行茯苓多糖超声提取工艺研究，以筛选茯苓多糖超声提取的最佳工艺条件。
       1  器材及药品
       
       茯苓(湖南靖州)。KQ-100DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司），紫外分光光度计（UV-2501，日本 岛津)，电子分析天平。葡萄糖标准品(供含量测定用，批号110833-200503，中国药品生物制品检验所)，苯酚，浓硫酸和铝片等。
       2  方法
       2.1  药材粉碎度的选择　超声波提取中，物料的粒度对提取效率有较大的影响，通常不同质地的物料需选择不同的粒度，才能保证较佳的提取效率。参照文献条件，取不同粒度茯苓药材，在乙醇浓度50%，提取温度45℃条件下超声提取20 min，考察粒度对茯苓多糖得率的影响。结果见表1。
       表1  药材粒度对多糖得率的影响（略）
       实验结果表明，药材粒度为20～60目时，提取时提取率较好。
       2.2  提取次数的选择  取20～60目粒度茯苓药材，在乙醇浓度50%，提取温度45℃，提取时间20 min条件下，分别提取1，2，3次，考察提取次数对茯苓多糖得率的影响。结果见表2。
       表2  提取次数对多糖得率的影响（略）
       结果表明，超声波提取1次后，茯苓多糖即已提取完全。
       2.3  茯苓提取物中多糖含量的测定方法
       2.3.1  4%苯酚溶液的配制取苯酚100 g，加铝片0.1 g和碳酸氢钠0.05 g，蒸馏并收集182 ℃馏分，称取4 g，在100 ml容量瓶加水溶解至刻度线，然后放冰箱内冷藏备用(一定要在182℃时收集其馏分)。在蒸馏过程中，还要控制好冷凝程度，若冷凝管内的水流量过快，则会很快使其中的馏分结晶而影响到馏分的正常收集。 
       2.3.2  制备标准曲线精密称取置五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h以上的无水葡萄糖标准品15 mg，置25 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀置室温下（约24℃）备用（浓度为0.6 mg/ml）。精密量取对照品溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，分别置于100 ml容量瓶中，并加水至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液2 ml，置具塞试管中，分别加入4%的苯酚溶液1 ml，混匀后迅速加入浓硫酸7.0 ml，摇匀，并于45℃水浴中保温30 min后取出，置冰水浴中5 min后取出。然后以第1份为空白对照组，用分光光度法在490 nm的波长处测定其吸收度A，以吸光度（A）为纵坐标，溶液浓度C为横坐标。统计，进行线性回归。得回归方程：Y=0.011 4+0.018 3X,相关系数r=0.999 5，葡萄糖浓度在0.006～0.03 mg/ml范围内吸光度与浓度呈良好的线性关系。
       2.3.3  苯酚-硫酸法测茯苓多糖含量将各提取方法所得样品制成1 g/ml的溶液，精密量取2 ml，照标准曲线的制备项下的方法，用紫外分光光度法测定其吸光度，从标准曲线的回归方程中计算出待测溶液浓度，并进一步计算出其多糖含量（以葡萄糖量计）。结果见表3。
       2.4  均匀实验设计及结果分析   根据茯苓多糖超声提取工艺的影响因素，选取乙醇浓度（因素水平下限0%，因素水平上限70%）、提取时间（因素水平下限20 min，因素水平上限60 min）、温度（因素水平下限25℃，因素水平上限75℃）、料液比（因素水平下限1∶5，因素水平上限1∶14）为考察因素，进行U*13(134)均匀实验设计表，并以茯苓多糖（以葡萄糖计）为评价指标，优选超声提取茯苓多糖最佳工艺。见表3。
       表3  U*13(134)均匀设计方案及结果（略）
       实验结果用多元回归处理，将表3结果输入均匀设计分析软件2.10。进行二次多项式逐步回归，得回归方程如下：Y = 0.876 4+ 0.976 8ＸA + 0.100 7ＸB + 0.296 9ＸC + 0.512 4ＸD(A为乙醇浓度，B为提取时间，C为提取温度，D为料液比)，复相关系数Ｒ＝0.9430；样本容量n＝13，显著性水平α＝0.05，检验值Ft＝16.07, 临界值F(0.05，4，8)＝3.838,Ft＞F(0.05，4，8)，回归方程显著。剩余标准差 ｓ＝0.295 9。各方程项对回归的贡献(按偏回归平方和降序排列)：U(A)＝5.202, U(A)/U＝92.44%； U(D)＝1.958e-9，U(D)/U＝3.480e-8%；U(C)＝9.781e-17，U(C)/U＝1.738e-15%，U(B)＝1.125e-17，U(B)/U＝1.999e-16%。第2方程项［B］对回归的贡献最小，对其进行显著性检验：检验值F(B)＝1.285e-16，临界值F(0.05，1，8)＝5.318，F(B)≤F(0.05，1，8)，此方程项不显著，需要剔除。
       
       剔除不显著方程项，新建回归方程继续计算：回归方程：Y =1.327 + 0.976 8ＸA + 0.196 2ＸC + 0.512 4ＸD (A为乙醇浓度，C为提取温度，D为料液比)。复相关系数R＝0.9430；样本容量n＝13, 显著性水平α＝0.05, 检验值Ft＝24.11, 临界值F(0.05,3,9)＝3.863, Ft＞F(0.05,3,9), 回归方程显著。剩余标准差 ｓ＝0.278 9。各方程项对回归的贡献(按偏回归平方和降序排列)：U(A)＝5.202,U(A)/U＝92.44%； U(D)＝1.431,U(D)/U＝25.43%；U(C)＝0.209 9,U(C)/U＝3.730%，第2方程项［C］对回归的贡献最小，对其进行显著性检验：检验值F(C)＝2.698，临界值F(0.05，1，9)＝5.117，F(C)≤F(0.05，1，9)，此方程项不显著, 需要剔除。
       
       剔除不显著方程项，新建回归方程继续计算：回归方程：Y = 1.971 + 0.918 0ＸA+ 0.453 5ＸD ，复相关系数R＝0.925 3。样本容量N＝13， 显著性水平α＝0.05， 检验值Ft＝29.76，临界值F(0.05，2，10)＝4.103，F t＞F(0.05，2，10)， 回归方程显著。剩余标准差ｓ＝0.301 7。各方程项对回归的贡献(按偏回归平方和降序排列)：U(A)＝5.048,U(A)/U＝93.18%；U(D)＝1.232,U(D)/U＝22.74%，第2方程项［D］对回归的贡献最小, 对其进行显著性检验：检验值F(D)＝13.54， 临界值F(0.05，1，10)＝4.965，F(D)＞F(0.05，1，10)，此方程项显著。
       
       多元回归中标准偏差回归系数显示，对茯苓多糖超声提取的影响效应依次为乙醇浓度、溶剂用量、提取温度和超声时间,其中提取温度和超声时间对茯苓多糖提取率的影响很小，没有显著性。依据回归方程和实际经验，选择茯苓多糖的最佳超声提取条件为提取溶剂为70%的乙醇，料液比为1∶10，提取温度25℃，超声提取时间20 min。
       2.5  验证实验按上述优化的超声提取条件，进行3次茯苓多糖的超声提取,结果得到优化条件下的茯苓多糖提取率为5.58%，与回归方程的预测值5.60%很接近，且重复实验相对偏差不超过2.5%，说明超声优化条件重复性良好。
       3  讨论
       
       茯苓多糖的超声提取方法简便，提取率高达5.58%左右，比常规提取方法的操作时间缩短10～20倍，而且多糖得率高。超声提取天然药物有效成分具有周期短、成本低、不破坏活性成分等显著优点，具有很好的应用前景。
       
       均匀设计,在条件范围变化大而需要进行多水平实验的情况下,可极大地减少实验的次数, 它只需要与因素水平数相等次数的q次实验即可获得正交设计的至少做q2次实验所能获得的实验结果。均匀设计只考虑实验点在实验范围内充分“均匀散布”而不考虑“整齐可比”， 因此实验的结果没有正交实验结果的整齐可比性, 其实验结果的处理多采用回归分析方法。均匀实验设计不但可找到最优的试验条件组合，而且还可建立可定量描述指标和因素间关系的数学模型［2］。
       【参考文献】
         　　［1］ 陈春霞.羧甲基茯苓多糖研究进展［J］.中国食用菌，2005，24(1)：17，26.
       
       ［2］ 方开泰. 均匀设计——数论方法在试验设计的应用［J］.应用数学学报，1980，3(4)：363.