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       【摘要】 
       目的观察平瘤合剂（PLM）对荷瘤鼠的治疗效果，探讨其作用机理。方法建立动物模型，灌服PLM，观测其抑瘤效果，并通过形态学、免疫组化、流式细胞仪等方法探明其作用机理。结果①PLM有较好的抑制SHG-44移植瘤增殖的效果，并呈现出一定的量效关系，且安全无毒作用；②流式细胞仪检测发现在治疗组中细胞凋亡增多，主要是使细胞阻滞于G0-G1期；③GFAP在高剂量组中高表达；④组织形态学上显示肿瘤的恶性程度有降低趋势，并在透射电镜下可见SHG-44细胞凋亡现象。 结论PLM能抑制实验性荷瘤鼠肿瘤的生长，其抗瘤机理是通过诱导细胞的凋亡，抑制胶质瘤细胞的增殖，并通过诱导其分化进而降低了胶质细胞瘤的恶性程度。
       【关键词】  平瘤合剂； 胶质细胞瘤； 细胞凋亡
       胶质瘤是神经外科常见的恶性疾病，约占颅内肿瘤的40%，虽然手术治疗是目前临床上的首选方法，但仍难以根除，具有很高的复发率，平均生存期6个月，综合治疗生存期不足两年［1］。人们一直在探索各种新的治疗方法。中医药疗法具有提高机体免疫力，改善症状，延长生存期的作用，笔者通过对临床上使用有效的平瘤合剂（PLM）这一方药进行实验研究。现报道如下。
       1  材料
       1.1  实验细胞人脑胶质瘤细胞系SHG-44为高度恶性的人脑胶质瘤细胞，由苏州大学附属二院脑肿瘤研究所提供。
       1.2  实验动物NC系裸小鼠为苏州大学附属二院动物中心提供，按SPF级要求管理，鼠龄6～8周，体重约为22 g左右，雌雄兼用，随机分为高剂量（PLMH）、低剂量（PLML）及对照(NS)3个观察组，每组12只。
       1.3   受试药物PLM由莪术、蛇六谷、川芎等中药组成，煎制成1∶1的浓度（每毫升中含有生药1 g）。
       1.4  主要试剂与仪器小鼠抗人GFAP单抗、羊抗小鼠FIRC抗体均购自华美公司。流式细胞仪为Becton Dickinson公司的 FACSCslibur型；透射电镜为日立公司H-600型。
       2  方法
       2.1  模型建立将指数生长期的SHG-44胶质瘤细胞约1×107穿刺接种于裸小鼠的右腋皮下，待瘤体生长至3  mm3时将鼠断颈处死，取出瘤块，剪碎，按上述方法传代，待生物学性能稳定，致瘤率为100%时用于实验。
       2.2  给药方法将原液以生理盐水倍比稀释一次后，制成高低两个剂量组，使用前高压灭菌备用，对照组给予生理盐水。经口灌胃1次/d，0.8 ml/次，连续6周。
       2.3  体重及瘤体的测量每周1次测量体重并记录；用游标卡尺测量瘤体的长短径，根据公式W=a×b2/2 (a为瘤体长径，b为短径)计算出瘤体体积；抑瘤率（%）＝（对照组肿瘤体积－治疗组肿瘤体积）/对照组的肿瘤体积×100%。
       2.4  细胞凋亡检测将荷瘤鼠断颈处死，迅速取出瘤块，置冰块上剪碎，PBS洗涤，过300目尼龙滤网，制备单细胞悬液，收集好的细胞离心、洗涤后，用1 ml DNA染液（PBS含1%Triton-X-100、0.5 μg/ml PI染料、20 μg/ml Rnase）室温染色30 min，过300目尼龙滤网，上机检测。
       2.5  GFAP的表达取瘤组织石腊包埋，常规病理切片，按照实验方法制片［2］，上镜观测。
       2.6  病理观察病理切片的制作方法同上，常规HE 染色，显微镜下观察各组的病理表现和特点。
       2.7  肿瘤组织的亚微结构取一小块瘤体剪成约1 mm×1 mm×1 mm的小块，浸入4%的戊二醛里固定2 h，后以PBS洗涤2次，15 min/次，再以1%的锇酸固定1 h，PBS洗涤后以浓度渐升的丙酮进行梯度脱水，用环氧树脂618包埋，渗透，聚合48 h后，用醋酸铀-柠檬酸铅染色后在日立H-600透射电镜下观察。
       2.8  统计学处理实验数据采用SAS软件分析，进行统计学处理。
       3  结果
       3.1  PLM对荷瘤鼠抑瘤作用的观察结果见表1。
       表1  各组瘤体积的变化（略）
       与对照组的比较，**P<0.01，*P>0.05；n=12
       3.2  体重的变化见表2。
       3.3  流式细胞仪检测 细胞周期分布：主要使细胞阻滞在G0/G1期，S期的比例明显随着剂量的增加逐渐减少。见表3。
       3.4  GFAP表达PLMH组中棕染细胞明显增多，PLML及N S两组中相对较少。
       3.5  组织病理NS组可见肿瘤细胞密集，细胞呈多形性，间质成分少，细胞核的形态异型性明显，胞浆少，细胞的极性消失，中间有较多的坏死及出血灶。PLML组中的肿瘤细胞较为密集，胞浆丰富。PLMH组中可见细胞排列整齐，胞核呈长梭形，间质成分明显增多，未见有出血及坏死的病灶，在近边缘的部位尚可见有淋巴细胞浸润。
       3.6  凋亡肿瘤细胞的亚微结构观察在电镜下可以清晰观察到在PLMH组中细胞核固缩现象，并出现典型的凋亡小体，部分细胞可见染色质边集的早期凋亡表现。
       4  讨论
       
       古代中医文献中无脑瘤病名的记载，但在头风、真头痛、厥逆、癫痫等疾病中有类似症状的描述。如《灵枢·厥病篇》云：“真头痛，头痛甚，脑尽痛，手足寒至节，死不治”。《中藏经》明确地指出：“头目久痛，卒视不明者，死”，这与脑瘤的临床表现及预后非常相似［3］。
       表2  各组体重的变化（略）
       与对照组的比较，*P>0.05；n=12
       表3  各组细胞周期的分布（略）
       与对照组的比较，*P>0.05；n=12
       
       中医认为，脑肿瘤多由肝肾亏虚，风痰淤毒内生，格于奇恒之府，痹阻脑络所致。肾主藏精，生髓，通于脑，脑为“髓海”， 正如《内经》云：“髓海不足则脑转耳鸣”、“诸风掉眩，皆属于肝”。脑瘤所致的头痛、眩晕、耳鸣、耳聋、肢麻、抽筋、口眼歪斜、半身不遂等症状均与肝肾两脏密切相关［4］。肝肾阴虚，肝阳上亢，化风内动，上扰清空，痰淤内阻，脑窍闭塞，脑中络脉痹阻。可见本病的基本病机为肝肾亏虚，痰淤阻络，毒邪内蕴［5］。我们曾对25例病人的证候进行归纳，证实了上述结果［6］，初步实验表明含该药兔血清对人脑胶质瘤细胞SHG-44具有细胞毒作用，能抑制人脑胶质瘤细胞的增殖，并随浓度的增高有相加效应，呈现一定的量效关系，含药血清能诱导胶质瘤细胞的凋亡［7］。
       
       诱导分化治疗着眼于解除肿瘤细胞的发育缺陷，可使瘤细胞最终成为正常或接近正常细胞，丧失增殖能力并诱发凋亡，从而成为控制肿瘤的一种新策略［8］。与常规杀伤性治疗相区别，诱导分化治疗的原理在于通过诱导使低分化的肿瘤细胞进一步分化成为接近正常的“成熟细胞”，致使大量细胞退出增殖周期转入静息状态，从而起到治疗的作用［9］。
       
       中药诱导肿瘤细胞的分化主要集中于一些中药提取的单体，如紫杉醇、榄香烯乳、槲皮素、三氧化二钾等，其结果尚不能完全说明中药服用后在体内复杂的作用过程，更不能等同于中药复方的复杂作用。本实验通过经口给予荷瘤鼠发现PLM对肿瘤增殖有较好的抑制效果，可促使分化标志蛋白GFAP的增加，从组织学上能使肿瘤的恶性程度降低，组织病理亦显示了同样的结果。同时，还观察到PLM有诱导SHG44细胞凋亡的作用。
       【参考文献】
         　　［1］ Mizuno M，Yoshida J．Tumor necrosis factor-α gene transfer augments anti-fas antibody-mediated apoptosis in human glioma cells［J］.Jpn Cancer-Res，1996，87(5)：543.
       
       ［2］ Alison M R ，Sarraf C E.Apoptosis: regulation and relevance to toxicology［J］.Hum Exp Toxicol，1995，14(3)：234.
       
       ［3］ 杨炳奎，霍介格．肿瘤的中医命名与分类［J］.中国中医基础医学杂志，2004，10(10)：19.
       
       ［4］ 霍介格，曹振健．脑肿瘤病因病机初探［J］.中医药研究，2001，17（3）：1.
       
       ［5］ 霍介格，顾 勤．周仲瑛治疗脑肿瘤的经验［J］.中医杂志，2007，18（5）：397.
       
       ［6］ 霍介格，王小宁．25例脑瘤临床证候分析［J］.中国中医急症，2007，1:61.
       
       ［7］ 霍介格，曹振健.平瘤合剂对人脑胶质瘤细胞SHG-44作用的实验研究［J］.江苏中医药，2004，25（12）：56.
       
       ［8］ 李伟生，黄 强，董 军，等.苯丁酸纳诱导分化治疗可移植性人脑胶质瘤实验研究［J］.中华神经外科疾病研究杂志，2002，1(2)：160.
       
       ［9］ 程 光，章 翔，费 舟，等.苦参碱BT325胶质瘤细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用［J］.第四军医大学学报，2002，23(23)：2152.