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       【摘要】 
       目的考察杞黄颗粒中挥发油的最佳提取工艺和β-CD最佳包合工艺。方法采用单因素以收油率作为评价提取工艺的指标；以包合物收得率和挥发油包合率的综合评分作为评价包合工艺的指标优选β-CD包合工艺。结果挥发油最佳提取工艺为：莪术加水6倍量，浸泡12 h，提取6 h；挥发油的最佳包合工艺为采用饱和水溶液法在一般温度下β-CD与挥发油的配比为6∶1，水与挥发油的配比为60∶1，包合时间为45 min。结论所选提取工艺提取率高，包合工艺合理可行。
       【关键词】  杞黄颗粒； 挥发油； β-CD包合物； 单因素实验； 正交实验
       Studies on the Extraction of Volatile Oil in Qihuang Granule and the Preparation of their CD Inclusion Compounds
       ZHONG Hua, YIN Rongli, ZHOU Shufang, ZHANG Dan, LI Yi
       (College of Pharmacology，Chengdu University of T.C.M，Chengdu 610075，China；Department of Pharmacology ,Luzhou Medical College，Luzhou 646000,China；Medicament Section ,North Sichuan Medical College，Nanchong 637007，China)
       Abstract：ObjectiveTo study the optimum conditions for the extraction of volatile oil in Qihuang Granule，and for the preparation of their β-CD inclusion compounds．MethodsThe study was carried out with single factor .With the percentages of extracted volatile oil as the target markers,the optimum conditions was determined for extraction of the volatile oil．With the ratio of inclusion and the oiling bearing from the inclusion as the target marker the conditions for including the oils with β-CD were optimized．ResultsThe optimized extraction conditions were：the water was 6 times of the herbs in weight，the herbal medicine of Rhizoma Curcumae should be extracted for 6 h after advanced soaking 12 hours with water．The optimal inclusion conditions were：applying the saturated aqueous solution method, under the nature temperature, the proportion of β-CD and oil was 6 g：l ml, the proportion of water and oil was 60 ml：l ml , the time was 45 minutes，respectively．ConclusionThe established process can be used for the extraction and the inclusion of volatile oil in Qihuang Granule．The obtained ratio of oil is high，the inclusion process is suitable．
       Key words：Qihuang Granule；  Volatile oil；  β-CD inclusion compounds；  Single factor test；  Orthogonal design test
       
       杞黄颗粒是由黄芪、枸杞、莪术、泽泻等中药制成的复方制剂，具有益气血、补肝肾、活血化淤的功效，多用于治疗年老体虚，气血不足，肝肾亏损引起的气血淤滞。方中莪术和泽泻均含有挥发油，尤其是莪术挥发油在发挥功能主治方面起重要作用，所以需要考虑挥发油的提取和包合问题。本实验采用单因素实验对挥发油提取工艺进行了研究，并采用正交实验对β-环糊精(β-CD)包合工艺进行了优选。
       1  仪器与试药
       
       BP211DAG电子天平(德国Sartorius)，SHZ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)，KDM型控温电热套，DL-720D型数控超声波仪(昆山市超声仪器公司)，挥发油测定器(上海玻璃厂)；莪术、泽泻药材(五块石中药材市场购买，经成都中医药大学中药鉴定教研室鉴定均符合《中国药典》2005年版规定)。β-环糊精(含量>99％，中国医药集团上海化学试剂公司)；水为重蒸馏水，无水乙醇、石油醚(沸程30～60℃)等其它化学试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  挥发油提取工艺的研究［1］
       2.1.1  挥发油的提取方法取药材，经适当粉碎后，称取适量药材粗颗粒置蒸馏烧瓶中，加入适量水以及玻璃珠数粒，振摇混匀，浸泡适当时间，连接挥发油测定器与回流冷凝管。置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸至规定时间；将提取得到的挥发油用无水硫酸钠脱水，石油醚洗涤多次，低温挥净石油醚后，得干燥的挥发油(为淡黄色液体)。
       2.1.2  挥发油的单提合提研究处方中莪术、泽泻均含有挥发油，且处方量之比为3∶2，故称取莪术240 g，泽泻160 g分别加8倍量的水各单独提取8 h至不再出油为止，以及莪术240 g，泽泻160 g同法混合提取。结果见表1。
       表1  挥发油单提与合提的考察（略）
       由表1知，莪术与泽泻混合提取挥发油量，基本上为莪术和泽泻单独提取的挥发油量之和。综上，本处方中挥发油来源主要是莪术，且据文献报道莪术油具有增强机体免疫能力，延缓衰老的作用，与本处方功能主治相应，确定莪术油为必提成分，而泽泻含油量极少，且对莪术油的提取也无多大促进作用，对本处方的治疗作用影响也不大，可以忽略不计，故仅考察莪术挥发油的提取工艺即可。
       2.1.3  吸水率考察称取适量药材置烧杯中称重，加水浸没药材并浸泡至透心后（3 h），滤过(不挤压)称重，计算得莪术药材吸水率为126.2％（n=3）。
       2.1.4  浸泡时间和提取时间的考察称取100 g莪术药材3份，各加8倍量水，分别浸泡0,4，6，12，16 h，共水蒸馏法提取8 h，记录每小时挥发油出油量（ml）。结果见表2。
       表2  浸泡时间和提取时间考察（略）
       由以上结果可得知，浸泡过后6 h挥发油基本能提完，以6 h为界，浸泡12 h提取挥发油最多，故选择浸泡12 h后提取挥发油。
       2.1.5  加水量考察称取100 g莪术药材3份，加水量分别为6，8，10倍，浸泡12 h，共水蒸馏法提取6 h，记录每小时挥发油出油量（ml）。见表3。
       表3  加水量考察（略）
       由表3结果可知，加水量对挥发油出油量影响不大，从节约可行出发，选用6倍量水即可。
       
       综上，初步确定挥发油提取工艺为6倍量水，浸泡12 h，共水蒸馏法提取6 h。
       2.1.6  验证实验为验证上述结果的准确性，以保证提取工艺的合理可行，按最佳工艺条件即6倍量水，浸泡12 h，共水蒸馏法提取6 h，得提油率为1.72％（n=3），考虑到企业大生产的现有设备和生产可行性，暂定挥发油收率不得少于1.0％。
       2.2  挥发油包合工艺研究［2～4］
       2.2.1  包合方法的选择经查阅文献资料，莪术挥发油的β-环糊精包合方法主要有研磨法和饱和水溶液法，决定通过实验，选择最适宜于莪术挥发油的β-环糊精包合方法。
       
       饱和水溶液法：称取β-环糊精适量，置于150 ml具塞三角瓶中，加入适量蒸馏水，水浴加热使溶解，降至实验温度，缓缓滴入挥发油乙醇溶液（体积分数50%），超声包合至规定时间后，置冰箱中冷藏12 h，抽滤，分别用石油醚（10 ml/次，各3次）洗涤包合物沉淀，抽滤，于40℃干燥4 h即得包合物。
       
       研磨法：称取适量的β-环糊精，加入等量蒸馏水，研磨均匀后，边研磨边缓缓滴入等量的挥发油乙醇溶液（体积分数50%），研磨均匀后，减压抽滤，弃去滤液，用石油醚（10 ml/次，各3次）洗涤包合物沉淀，抽滤，于40℃干燥4 h即得包合物。结果见表4。
       
       表4  β-环糊精包合预实验结果（略）
       由预实验可知饱和水溶液法的包合率和收得率均高于研磨法，所以决定采用饱和水溶液法进行莪术挥发油的β-环糊精包合。
       2.2.2  包合工艺条件筛选莪术挥发油的β-环糊精包合，选择加水量/挥发油，β-环糊精/油，超声时间3个影响最大的因素，各取3个水平，按L9（34）表进行正交实验，筛选最佳包合条件。见表5～7。
       表5  挥发油β-环糊精包合的因素-水平表（略）
       评价指标：包合率是衡量包合效果的重要指标，包合率越高，包合效果越好，因而作为包合工艺筛选的主要指标，权重系数定为0.6；收得率在大生产中也很有意义，在β-环糊精和挥发油投入量一定的情况下，收得率越高，包合效果越好，故收得率作为次要筛选指标，考虑本挥发油比较好包合，收得率也较高，故权重系数定为0.4。
       
       包合率（%）=包合物中实际含油量/（挥发油的投入量×空白回收率）×100%
       
       收得率（%）=包合物重量/（β-环糊精投入量+挥发油投入量）×100%
       
       空白回收率（%）=实际收油量/加入挥发油量×100%
       
       包合物中实际含油量的测定方法：将所得的干燥包合物精密称定，置装有沸石的圆底烧瓶中，加蒸馏水100 ml，连接挥发油提取器，按《中国药典》2005年版Ⅰ部附录挥发油测定项下有关规定进行，加热煮沸至油量不再增加时，停止加热，放置30 min后读取挥发油量。
       
       挥发油空白回收率测定：精密吸取挥发油1.0 ml ，置圆烧瓶中，加入蒸馏水100 ml，按上述操作进行，计算空白回收率为88%。
       
       实验结果：具体结果见表6～7。
       表6  挥发油包合工艺正交实验结果（略）
       表7  方差分析（略）
       *P＜0.05
       
       由直观分析可知，影响挥发油包合的因素顺序为：A>C>D，以A的影响最大。经方差分析可见，水∶油比例对挥发油的包合有显著性影响，β-环糊精∶油比例及包合时间无显著影响；最佳提取工艺为：A1B2C3。虽然β-环糊精∶油比例影响最小，但考虑到后面的成型工艺β-环糊精有利于制剂的成型，6倍量的β-环糊精也是最佳配比，故选择B2，为了保证包合效果，包合时间仍取最佳水平C3。选择最佳工艺为A1B2C3，即用6倍量的β-环糊精加60倍的水超声包合45 min。据此条件，并将A和C各调低和调高一个水平进行对比验证，因素设计同表5。结果见表8。
       表8  对比实验结果（略）
       对比实验表明最佳工艺还是A1B2C3，由于包合温度也是影响包合效果的一个因素，因此，考虑采用单因素法考察包合温度。在水∶油的比例、环糊精∶油的比例以及超声时间(min)确定的情况下，分别在200，300，450，600℃，进行包合。结果见表9。
       表9  不同温度包合实验（略）
       结果表明在20～45℃的范围内，包合效果都较好，但如果达到60℃，收得率将大大降低，所以在一般温度下包合即可。
       2.3  验证实验在常温下，用最佳包合工艺，即6倍量的β-环糊精加60倍的水超声包合45 min，置冰箱中冷藏12 h，抽滤，分别用石油醚（每次10 ml，各3次）洗涤包合物沉淀，抽滤，于40℃干燥4 h得包合物，验证实验包合率（%）为80.88%（n=3），收得率（%）为89.79%（n=3）。结果与正交实验结果基本一致，说明挥发油的包合工艺条件稳定，具有重复性。
       3  讨论
       
       莪术挥发油易挥散和氧化，直接加入到制剂中易损失或发生变化而影响制剂的质量，且性味辛苦，经环糊精包合后由液态变为固态，可减少贮存中的氧化、变质及挥发损失，便于调剂、制剂成型，使挥发油的稳定性得到改善，且矫正了制剂的不良气味，便于服用。
       
       本实验对包合前后挥发油进行了薄层色谱鉴别，鉴别条件为:硅胶G薄层板（0.5%CMC-Na为粘合剂，厚度约为0.5 mm）;展开溶剂为石油醚—醋酸乙酯（20:3）；展开方式：饱和20 min，预平衡15 min，上行展开，展距为15 cm；检视：展开，取出，晾干，10%浓硫酸乙醇试液，105℃至斑点显色清晰（见图1）。结果挥发油包合前后色谱图完全一致，表明其组分未改变，适用于生产运用。
       图1  薄层色谱验证实验结果（略）
       【参考文献】
         　　［1］ 谢秀琼.中药新制剂开发与应用，第2版［M］.北京：人民卫生出版社,2000：155.
       
       ［2］ 孙 琴,税丕先,何 兵，等.β-环糊精包合颅痛安颗粒剂中挥发油成分的工艺研究［J］.时珍国医国药,2006,l7(7):1225.
       
       ［3］ 邸多隆,马华侨,吴子昌，等.莪术挥发油提取及包合工艺的研究［J］.精细化工,2003,20(3):167.
       
       ［4］ 李 丹,许 江,夏顺宁，等.β-环糊精包合莪术挥发油的工艺研究［J］.中药材,2003,27(11):866.