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       【摘要】 
       目的研究人参水提物（water extracts of Ginseng, WEG）对β淀粉样蛋白（Aβ2535）诱导SHSY5Y细胞凋亡的保护作用。方法用Aβ2535诱导体外培养的SHSY5Y细胞凋亡，并用WEG进行保护。MTT法检测细胞存活率，Hoechst33258染色观察细胞形态的变化，流式细胞仪分析亚二倍体峰和DNA含量，检测细胞凋亡。结果Aβ25-35 50 μmol/L诱导SHSY5Y细胞72 h后，镜下观察到细胞变圆，损伤并聚集，Hoechst33258染色可见明显的颗粒状和固缩状荧光，流式细胞仪检测到明显的亚二倍体峰，凋亡率达(37.30±0.69)%。而Aβ25-35和不同浓度的WEG(1，5，10，15 mg/ml)同时处理后，细胞形态明显改善，MTT值显著高于Aβ25-35处理组（P<0.01），流式细胞仪检测凋亡率分别降低到(14.70±3.18)%，(7.23±1.51)%，(6.14±0.40)%，(5.88±1.33)%，呈现剂量依赖关系。结论人参水提物对Aβ2535诱导的SHSY5Y细胞凋亡有显著的保护作用。
       【关键词】  SHSY5Y细胞； Aβ2535； 人参水提物； 细胞凋亡　
       Neuroprotective Effects of Water Extract of Ginseng on SHSY5Y Cell Apoptosis Induced by Amyloid β Peptide
       HU Shengquan,YU Huiming*,LIU Tasi,YANG Dajian,CHEN Xinzi,HE Cuijun
       (Hunan University of TCM, Changsha, 410007, China; State Key Laboratory of Chinese Medicine and Molecular Pharmacology, Shenzhen, 518057, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the neuroprotective effects of water extract of Ginseng on SHSY5Y cell apoptosis induced by Amyloid β peptide .MethodsSH-SY5Y cells were treated with Aβ2535 to induce apoptosis in vitro, water extract of Ginseng was added into the culture to test its neuroprotective effects. The cell viability was measured by MTT test,the morphology of SHSY5Y cells was observed by Hoechst33258 staining and DNA content by FCM. ResultsTreated by Aβ25-35 50μmol/L 72h later, SHSY5Y cells turned rounder , aggregated and were positively stained with fluorochrome Hoechst 33258.Cells displayed a typical subdiploid peak in flow cytometry ,and the percentage of apoptosis was (37.30±0.69)%（P<0.01）. When incubated with Aβ2535μmol/L and different concentrations(1，5，10，15 mg·ml-1) of WEG for 72 h, the characteristics of apoptosis as measured by FCM dosedependently declined to (14.70±3.18)%,(7.23±1.51)%,(6.14±0.40)% and (5.88±1.33)% respectively (P<0.05).ConclusionWater extract of Ginseng has marked neuroprotective effects on SH-SY5Y cell apoptosis induced by Aβ2535.
       Key words：SH-SY5Y cells；  Amyloid β peptide；  WEG；  Apoptosis
       
       阿尔茨海默症(Alzheimer"s Disease，AD)，俗称老年痴呆症，为常见的中枢神经系统退行性疾病，是一种在正常意识状态下丧失智能能力的疾病。随着全球人口老龄化的程度加快，AD等神经退行性疾病在老年人中的发病率居高不下，给社会和家庭带来了沉重的负担。由于AD发病机制复杂，目前临床用于治疗AD的药物均只对发病过程中的某一或某几个环节起效，但副作用大。中药由于在防治AD等老年性疾病方面有丰富的实践经验及毒性相对小等潜在优势，越来越受到医学界的重视和推崇。本课题选择包含Rg1，Rb1等众多具有益智作用成分的人参，以中医药理论为指导，按照中药的传统煎煮法，制成水提物冻干粉，以Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡作为神经元损伤的体外模型，观察人参水提物对神经元的保护作用。
       1  材料与方法
       1.1  试剂Aβ25-35 (Sigma公司)；1640培养基(Gibico公司)；FBS(Hyclone公司)；Trypsin(Gibico公司)；MTT(Sigma公司)；DMSO(Sigma公司)；Hoechst33258(Fluka)；PI(Sigma公司)；RNase(sigma公司)；人参(深圳华辉药业有限公司，产地吉林，经湖南中医药大学药学院刘塔斯教授鉴定为人参)。
       1.2  仪器CO2培养箱，美国Shellab；倒置荧光相差显微镜，德国Leica公司(型号：DC300)；超净工作台，ESCO公司；离心机，德国Hettich公司(型号：Rotofix32)；低温离心机，美国Coulter公司(型号：AllegraTM 21R)；流式细胞仪，美国Coulter公司(型号：Epics XL)；酶标仪，德国BMG公司(型号：Polar star Galaxy)。
       1.3  药物制备
       1.3.1  人参水提物取100 g人参粉碎，加8倍蒸馏水浸泡30 min，水浴2 h，纱布过滤，滤渣先后加6倍，4倍量水，各提30 min。3次滤液合并，冷冻干燥，得到40 g冻干粉，得率40%。冻干粉溶于灭菌去离子水，12 000 g，离心5 min，上清液过0.22 μm的滤膜，培养基稀释成实验所需浓度(以生药浓度计)。
       1.3.2  Aβ25-351 mg Aβ25-35溶于943 μl灭菌去离子水，配制1 mmol/L的母液，-20℃保存，用前37℃老化7 d，培养基稀释成实验所需浓度。
       1.4  细胞培养及预处理SH-SY5Y细胞取自本实验室细胞库。用含有体积分数为10%的FBS，1%的NEAA（非必需氨基酸）的1640完全培养基，于37℃，5%的CO2孵箱中培养。4 d进行1次传代，传代按1∶3进行。取生长期细胞进行实验。
       1.5  实验分组将细胞分3组。正常对照组：常规加入完全培养基；Aβ25-35模型组：加入Aβ25-35；WEG保护组：同时加入Aβ25-35和不同浓度的WEG。
       1.6  观察指标和方法
       1.6.1  倒置显微镜观察细胞形态SH-SY5Y 以7×104 cells/ml密度接种于6孔板，模型组用终浓度为0，5，10，25，50 μmol/L 的Aβ25-35分别作用24，48，72 h，WEG保护组用0，1，5，10，15 mg/ml WEG 与Aβ25-35共同孵育（Aβ25-35作用浓度和时间点根据上述结果而设），每组均3个复孔，于倒置显微镜下观察并拍照。
       1.6.2  MTT测定细胞存活率取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×104 cells/ml，以100 μl/well接入96孔板，37℃，5%的CO2孵箱中培养36 h。36 h后吸弃旧培养基，正常对照组加入100 μl的新鲜培养基，Aβ25-35损伤组加入100 μl含有Aβ25-35的培养基，WEG保护组加入100 μl含有Aβ25-35和不同浓度的WEG的培养基，各浓度6个复孔。药物作用68 h后，每孔加5 mg/ml的MTT(PBS配)10 μl，4 h后，弃培养液，加DMSO150 μl/孔，轻轻振荡10 min，使甲臢颗粒溶解，用酶标仪在570 nm处读取吸光度(OD)值，取6孔均值按下列公式计算，细胞存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。
       1.6.3  Hoechst 33258染色形态学观察将SH-SY5Y细胞（7×104/ml）接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予不同的处理因素后，加入新鲜配制的4％多聚甲醛（pH为7.4）于37 ℃固定细胞30 min，PBS液洗两次，加5 mg/L Hochest 33258 染色液染色30 min，PBS液洗后，用封片液（20 mmol/L柠檬酸，50 mmol/L磷酸氢二钠，50％甘油，pH 5.5）封片后荧光显微镜观察、摄片。
       1.6.4  PI单染流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期调整细胞密度为7×104 cells/ml，以1.5 ml/well种入6孔板。分组和处理同上。每组6个复孔。药物作用72 h后，细胞刮刮取细胞，1 000 r/min离心10 min，去上清，PBS漂洗两次，沉淀中缓慢依次加入70％的冰乙醇固定。-20℃固定24 h。固定后，1 000 r/min离心10 min，去上清，PBS漂洗两次，调整细胞浓度为1×106/ml。加RNase至终浓度100 μg/ml，37 ℃水浴30 min。加PI 至终浓度50 μg/ml，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4 ℃避光染色30 min后，上流式细胞仪检测（激发波长：488 nm；发射波长：610 nm）各期细胞DNA的含量。每组3个复孔。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA组方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞的多少。
       1.6.5  统计学处理全部数据采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，数据用±s表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验。
       2  结果
       2.1  Aβ诱导SH-SY5Y凋亡浓度和时间的确定镜下观察发现对照组细胞形态正常，有明显的轴突（图1a所示），而模型组细胞随时间推移和Aβ25-35浓度升高，细胞损伤逐渐增强，胞浆黯淡，出现空泡和小斑点，轴突消失，细胞皱缩并聚集成簇，各浓度在72 h损伤严重，出现细胞肿胀，胞膜破裂，胞内容物释放，包间沉积物聚集（图1b所示）。流式检测发现，50μmol/L Aβ25-35作用SH-SY5Y 细胞72 h后，凋亡率达(37.30±0.69)%，较对照组有明显的统计学差异，Hoechst 33258染色也发现有蓝色的颗粒状和固缩状荧光等典型的凋亡特征（图1e所示）。Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的最佳浓度和时间为50 μmol/L和72 h。
       2.2  WEG对Aβ诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响镜下观察发现Aβ25-35和不同浓度的WEG(1，5，10，15 mg/ml)同时孵育SH-SY5Y 细胞72 h后，细胞形态都得到明显改善，胞浆均匀，大部分细胞出现轴突，细胞斑点和沉积物少。5，10，15 mg/ml WEG组较1 mg/mlWEG组抗凋亡作用更为明显（图1c所示）。
       2.3  结果各组细胞MTT值如表1所示，与正常对照组相比，Aβ25-35处理组A值显著降低(P<0.01), Aβ25-35和WEG同时孵育后，A值显著升高(与模型组比较P<0.05)，说明WEG对Aβ25-35诱导的SH-SY5Y 细胞损伤有明显的保护作用。
       表1  WEG对Aβ25-35引起的SH-SY5Y细胞毒性的细胞存活率的影响（略）
       与正常对照组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
       2.4  Hoechst 33258的染色分析结果如图1 所示，正常对照组细胞核出现弥漫均匀的低强度荧光（图1d），而Aβ25-35模型组细胞核呈浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光（图1e），WEG和Aβ25-35同时给入细胞后，固缩形态和颗粒状荧光显著减少（图1f）。
       图1  WEG对Aβ25-35引起的细胞形态和凋亡的保护作用（略） 
       2.5  流式细胞仪DNA倍体分析结果如图2和 图3所示，50 μmol/L Aβ25-35作用SH-SY5Y细胞72 h后，凋亡率为(37.30±0.69)%，与对照组（1.56±0.80）%比较，差异具有显著性意义（P<0.05），WEG与50 μmol/L Aβ25-35共同孵育后，凋亡率随WEG浓度升高而降低，1，5，10，15 mg/ml WEG作用于Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡时，其凋亡率分别降低到(14.70±3.18)%，(7.23±1.51)%，(6.14±0.40)%和(5.88±1.33)%，与Aβ25-35损伤组比较差异具有显著性差异（P<0.05）。从细胞周期分析(表2)来看，Aβ25-35作用SH-SY5Y后，细胞周期发生了明显改变，除亚二倍体峰明显增加外，G0/G1和G2/M期比例较对照组下调明显。WEG和Aβ25-35共同孵育后，G0/G1期细胞存活比例随浓度依赖性增加，S期细胞比例较模型组明显减少，说明WEG对凋亡细胞的各个周期都有不同程度的阻滞作用，其主要作用体现在G0/G1期。
       表2  Aβ25-35和/或WEG作用SH-SY5Y细胞后细胞周期分析（略） 
       与正常对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，**P<0.05
       图2  Aβ25-35和不同浓度WEG作用SH-SY5Y细胞后流式分析（略） 
       图3  WEG对Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用（略） 
       3  讨论
       
       AD多发于老年人，临床表现为进行性记忆力减退，认知功能障碍等，其病因和发病机制错综复杂，众多研究者从不同角度提出各种发病假说，如基因突变假说、氧化应激及兴奋性毒性假说等，近年来，淀粉样蛋白假说及其相关的凋亡假说受到越来越多研究者的关注，该学说认为Aβ的聚集在AD发生发展过程中起核心作用，Aβ激发神经元细胞的凋亡进程，导致神经细胞功能紊乱和死亡，最终引起痴呆，细胞过度凋亡可能是神经元退行性病变的原因［1，2］。Aβ是β淀粉样蛋白前体(APP)的一个39～43个氨基酸片段，有神经毒性，包括Aβ25-35，Aβ1-42，Aβ1-40。其中Aβ25-35代表了最具毒性Aβ的生物活性片段［3］。本实验采用Aβ25-35作为神经细胞凋亡的诱导剂。
       
       人参是我国的传统中药，有大补元气、宁身益智、益气生津、补虚扶正、延年益寿之功效，被誉为“益气要药”。现代研究证明，人参中的主要成分皂苷具有明显的促智作用［4～6］。
       
       但大多数研究均是以皂苷单体（如Rg1,Rb2等）作为研究对象［7，8］，本实验遵循中医药理论的整体治疗观，秉承中药的临床指导原则，采用传统煎煮方法，用人参水提物冻干粉作为研究对象，以Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡做为AD模型，证明高浓度聚焦状的Aβ25-35可诱导SH-SY5Y凋亡。而不同浓度的人参水提物可显著降低Aβ25-35引起的高凋亡，对神经细胞有明显的保护作用。在实验过程中，以往大多数研究先将药物预孵育，而后加入造模剂Aβ25-35，体现的是预防作用［9，10］。我们将Aβ25-35和人参水提物同时给入细胞，体现更多的是人参水提物对AD的治疗作用。本课题研究为AD的临床防治提供了一定依据，今后可从凋亡相关基因蛋白等方面深入研究人参水提物对Aβ25-35诱导SH-SY5Y凋亡的保护作用机制，进一步进行新型防治AD中药的筛选。
       【参考文献】
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