文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究我国石斛属植物间的亲缘关系。方法从55个ISSR引物中筛选出14个多态性好的引物对石斛属（Dendrobium）植物基因组DNA进行简单重复间序列（ISSR）分析。利用POPGENE32软件计算ISSR扩增产物的Nei"s基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I），标记系统的有效等位基因数(effective number of alleles, NE)。应用NTSYS（3.0）软件计算Nei"s遗传距离和遗传相似系数。按照非加权平均距离法(UPGMA)构建聚类关系图。结果14条引物共扩增出123条带，多态性带112条，约占总数的91.06%，平均每个引物扩增的DNA带数为8.79条。Nei"s基因多样性指数（H）为0.351 9，Shannon信息指数（I）为0.528 2，有效等位基因数（NE）为1.594 5，种间的相似系数介于0.090 9～0.695 7，平均为0.377 9。结论我国石斛品种的遗传基础比较丰富，ISSR分子标记构建的亲缘关系树状图与经典分类系统基本一致。
       【关键词】  石斛； 简单重复间序列； 遗传多样性
       Genetic Diversity of Dendrobium Species (Orchidaceae) Plants in China by ISSR
       YUAN Zuoqing, ZHANG Jianyong, LIU Tao
       （School of Life Science, Shandong University of Technology, Zibo, Shandong 255049, China）
       Abstract：ObjectiveTo probe the relationship among Dendrobium species (Orchidaceae). Methods14 primers with good polymorphism screened from 55 ISSR primers were used to conduct ISSR analysis and dimorphic data of DNA fragments were used to construct the dendrogram by UPGMA.ResultsTotally 123 bands were amplified and 112 of them were polymorphic accounting for 91.06%. The average number of DNA bands amplified by each primer was 8.79. Nei"s gene diversity (H), Shannon"s information index (I) and effective number of alleles(NE) were 0.351 9, 0.528 2 and 1.594 5, respectively. The genetic similarity among all the tested clonal cultivars ranged from 0.090 9 to 0.695 7, averaging 0.377 9, which indicated that the genetic basis was relatively rich. ConclusionClustering results revealed that the dendrogram constructed with ISSR molecular makers was identical with the classic taxonomic system.
       Key words：Dendrobium;  ISSR;  Genetic diversity
       
       石斛（Dendrobium Sw.）是我国传统贵重中药材，药用历史悠久，具有滋阴养胃、生津止渴的功效。分布于亚洲热带、亚热带地区和太平洋岛屿，我国有74个种和2个变种，主要分布于秦岭淮河以南诸省［1］，已被国家列为濒危灭绝的植物药材之一。石斛种质资源丰富，来源和学名比较混乱［2］，同属植物作石斛入药的种类复杂，不同来源的石斛在化学成分、含量及药理活性等方面有一定差异［3］，同时人们对石斛属种质资源种的分类和演化等方面的研究较少，这都阻碍了石斛种质资源的合理挖掘利用。我们应用简单重复间序列（inter-simple sequence repeat, ISSR）标记技术对28种石斛进行分析，以确定它们之间的遗传差异和种间亲缘关系，为石斛属植物系统学研究、种质资源的保护和利用提供科学依据与参考。
       1  器材与方法
       1.1   材料 实验所用石斛植物采自我国石斛主产区：云南、安徽、广东、贵州等省区的原始森林，现被整丛栽种于山东理工大学生命科学学院植物组织培养实验室，以便及时取材和观察（见表1），实验样品经开花鉴定。
       1.2  仪器与试剂 PCR仪（PTC-200, MJ Research, Inc, USA)；电泳仪（DYY-8C型；北京六一仪器厂）；电泳槽（DYCp-34A型；北京六一仪器厂）；Heraeus Stratos离心机；Alpha2200凝胶成像系统。
       
       Taq DNA 聚合酶、dNTPs和200 bp DNA ladder（北京天根公司），Agarose（Promega公司），CTAB（Sigma 公司），溴化乙锭（Fluka公司），Tris-HCl（Ultra Pure）、EDTA和巯基乙醇（上海生工公司）。ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的序列，由上海生工生物技术服务有限公司合成。
       表1  实验材料来源及采集地（略）
       1.3   方法
       1.3.1  总DNA的提取 取各样品新鲜原植物的叶片，采用CTAB法提取基因组DNA［4］。用1%琼脂糖凝胶电泳检测质量，用紫外分光光度计检测浓度，最后稀释标定到10 ng/μl备用。
       1.3.2   ISSR分析 从55个引物中筛选出14个扩增谱带清晰且呈多态性的引物用于石斛材料的扩增（见表2）。PCR反应在PTC-200型梯度热循环仪（MJ Research）上进行，ISSR-PCR扩增反应条件经过比较和优化确定为25 μl的PCR反应体系，其中包括20 mmol/l KCl，10 mmol/L Tris-HCl (pH 9.0)，1.5 mmol/L MgCl2，100 μmol/L dNTP，20 ng基因组DNA，2U Taq聚合酶和0.1 μmol/L引物。PCR扩增程序为94℃预变性7 min；94℃变性45 s，50℃复性45 s，72℃延伸2 min，循环40次，72℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用200 DNA ladder作为分子质量标记，用Alpha2200凝胶成像系统观察结果并拍照记录。
       表2  ISSR引物的多态性（略）
       1.3.3  数据处理 每个样品的扩增带按有或无记录，“有”赋值为1，“无”赋值为0。利用POPGENE32软件计算ISSR扩增产物的Nei"s基因多样性指数（H）［5］和Shannon信息指数（I）［6］，标记系统的有效等位基因数(effective number of alleles, NE)。应用NTSYS（3.0）软件计算品种间Nei"s遗传距离和遗传相似系数［7］。根据遗传距离，按照非加权平均距离法（UPGMA）构建聚类关系图。
       2  结果
       2. 1  引物筛选和遗传多样性分析 ISSR扩增片段的大小在200～2 000 bp之间（见图1）。14个ISSR引物共扩增出123条带，其中多态性带有112条，多态性比率（PPB）为91.06%。各引物检测到的ISSR位点数不尽相同，在4～16之间，平均每个引物可检测出8.79个位点（见表2），平均多态性位点比率范围为66.7%～100%。每个位点的有效等位基因数（Ne）为1.594 5，Nei"s基因多样性指数（H）为0.351 9，Shannon信息指数（I）为0.528 2。材料间的遗传相似系数（GS）分布在0.090 9～0.695 7之间，平均相似系数为0.377 9，以上数据表明，石斛植物具有较丰富的遗传多样性。
       图1  引物UBC807的ISSR扩增谱带（略）
       2. 2  聚类分析 根据ISSR标记计算的Nei" s 遗传距离矩阵，按UPGMA法构建了28种石斛植物间的遗传关系聚类图（见图2）。由图2可见，试验材料分为5个类群，第1类包括石斛组的铁皮石斛、金钗石斛、晶帽石斛、樱石斛、细茎石斛、线叶石斛、滇桂石斛、流苏石斛和大苞鞘石斛，以及黑毛组的黑毛石斛和翅梗石斛，而《中国植物志》并未对喉红石斛进行划分，本实验支持喉红石斛划分在石斛组；石斛组的霍山石斛、尖刀唇石斛、束花石斛、曲茎石斛、疏花石斛和距囊组的红花石斛划分为第2类；石斛组兜唇石斛、肿节石斛、报春石斛、独角石斛、细叶石斛、玫瑰石斛和禾叶组的竹枝石斛划分为第3类；顶叶组的密花石斛和鼓槌石斛为第4类；第5类是圆柱叶组的海南石斛。聚类结果显示ISSR分子标记构建的亲缘关系树状图与经典分类系统较一致，在分子水平上显示了我国部分石斛属植物间的亲缘关系。
       3  讨论
       3.1  中国石斛植物资源的遗传多样性 石斛经长期的异花授粉和自然选择，其遗传背景非常复杂，某些种之间的形态特征相差甚远。中药石斛类药材基源复杂，混乱现象严重，因此研究石斛植物的遗传多样性是非常必要的。SSR序列的进化率比大多数其他类型的DNA都高，容易出现高度变异，因此ISSR标记可检测出基因组许多位点的差异而表现出较高的多态性［8］。我们用ISSR标记技术对28种石斛植物进行了基因组DNA多态性分析，结果显示ISSR分子标记能确立它们之间的亲缘关系，表明我国石斛植物资源十分丰富，存在着很高的遗传多样性。
       图2  基于ISSR数据的石斛属植物遗传分化聚类图（略）
       3.2   ISSR技术在石斛属植物研究中的应用 在石斛植物形态分类方面吉占和曾把我国石斛属的57个种划分为9个组［1］，分别为剑叶组、圆柱叶组、禾叶组、心叶组、基肿石斛组、草叶组、黑毛组、顶叶组、大花石斛组。《中国植物志》把我国石斛属的74个种划分为12个组，分别为禾叶组、顶叶组、石斛组、心叶组、瘦轴组、叉唇组、距囊组、黑毛组、草叶组、基肿组、剑叶组、圆柱叶组。本研究在分子水平上的ISSR聚类结果与经典的形态分类学结果基本一致，在分子水平上显示了我国部分石斛属植物间的亲缘关系，ISSR检测到的仅是石斛基因组的部分位点，需积累更多的ISSR检测位点并结合其它DNA分析技术对其系统分类与亲缘关系做出更科学的评价，也存在与经典分类学结论不完全吻合的地方，在阈值0.42处，黑毛组的黑毛石斛和翅梗石斛、距囊组的红花石斛和禾叶组的竹枝石斛分别与石斛组聚为三类，还需要进一步探讨。
       【参考文献】
         　　［1］ 吉占和.中国石斛属的初步研究［J］. 植物分类学报,1980,18（4）:427.
       
       ［2］ 王德群,彭华胜. 霍山石斛的名实混乱与原植物［J］. 中国中药杂志,2004,29（12）:1198.
       
       ［3］ 白 音,王文全,包英华,等. 不同产地美花石斛形态及多糖含量比较研究［J］. 中药材,2007,30(2):130.
       
       ［4］ 彭 锐,宋洪元,李泉森,等. 石斛总DNA的提取及鉴定［J］. 中国中药杂志,2003,28（12）:1129.
       
       ［5］ Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1973, 70: 3321.
       
       ［6］ Lewontin R C. Apportionment of human diversity［J］. J Evol Biol, 1972, 6: 381.
       
       ［7］ Nei M, Li W H. Mathematical models for studying genetic distance in terms of restriction endonucleases［J］. Proceeding of the National Academy of Sciences, 1979, 76: 5269.
       
       ［8］ Fang D Q, Roose M L, Krueger R R, Federici C T. Fingerprinting trifoliate orange germplasm accessions with isozymes, RFLPs and inter-simple sequence repeat markers［J］. Theor Appl Genet, 1997, 95: 211.