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       【摘要】 
       目的研究水龙骨对人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721的生长增殖抑制作用。方法制备水龙骨含药血清，用MTT法观察细胞增殖情况。结果水龙骨含药血清在体外对人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721均有抑制作用，对HepG2的最高抑制率为87.4％，对SMMC7721的最高抑制率为85.9％，抑制肝癌细胞的效果优于含5-氟尿嘧啶血清。结论水龙骨对肝癌细胞的体外增殖有明显的抑制作用。
       【关键词】  水龙骨； 人肝癌细胞株； 抗癌效应； 大耳白免； 含药血清
       Study on Antihepatocarcinoma Property of Polypodiodes niponica in vitro
       WANG Yuliang，  LV Jing，ZHANG Lei*，XIN Hailiang
       (School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240,China; Department of Pharmacognosy , Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016,China; Department of Pharmacognosy, School of Pharmacology, Second Military Medical University, Shanghai 200433,China;  No. 546 Hospital of PLA, Malan Xinjiang 841700,China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the inhibitory action of Polypodiodes niponica on the proliferation of HCC cell line HepG2,SMMC-7721 in vitro. MethodsThe serologic pharmacological method and MTT assay were used. ResultsPolypodiodes niponica had some inhibitory effect on tumor cell proliferation in vitro．The proliferation of HepG2、SMMC-7721 cells was obviously inhibited after being treated with Polypodiodes niponica. The highest inhibitory rate on HepG2 was 87.4％ and that of SMMC-7721 was 85.9％. ConclusionPolypodiodes niponica has obvious effect of inhibiting the proliferatory of HCC cell line.
       Key words：Polypodiodes niponica;  HCC cell line;  Inhibition action;   Rabbit;   Pharmaceutic serum
       
       水龙骨始载于《本草纲目拾遗》，以草石蚕名之《植物名实图考》名之水龙骨，列入石草类，来源为水龙骨科植物水龙骨Polypodiodes niponica (Mett.) Ching的干燥根茎，性味苦、凉，可化湿，清热解毒，祛风通络，治痧秽泄泻、痢疾、淋病白浊、风痹腰痛、筋骨酸痛、跌打损伤等症［1,2］。现代药理研究证实其具有抗炎和抗纤维化作用［3］。
       
       笔者通过在江浙一带大量的调研，发现水龙骨在当地医院和民间被广泛地用于治疗慢性乙型肝炎及其相关性肝癌和肝癌晚期腹水症，疗效较好。为进一步确证其抗癌活性，本实验应用血清药理学方法，观察其对人肝癌细胞增殖的抑制作用。
       
       1  材料
       1.1  试剂和设备 水龙骨药材采自浙江天目山，经第二军医大学生药教研室张汉民教授鉴定为水龙骨科植物水龙骨Polypodiodes niponica的干燥根。药材粉碎后过100目筛，70%乙醇渗漉提取，渗漉液浓缩至浸膏，4℃存放备用。DMEM培养液、胎牛血清、胰蛋白酶由美国Gibco公司提供，MTT及其他常用试剂购自美华公司。CO2培养箱购自德国Hereus，ST-360酶标仪购自科华公司 。
       1.2  动物与细胞 日本大耳白兔购自上海斯莱克实验动物中心，动物合格证号：SCXK（沪），雄性，体重(2.5±0.2) kg；人肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721由第二军医大学药理实验室提供。
       2  方法
       2.1  含药血清的制备 参考文献［4］的方法，动物随机分成3组，每组3只。空白组，生理盐水每日灌胃；阳性组，5-氟尿嘧啶每日按100 mg/kg灌胃给药；水龙骨组，每日按生药量计10 g/kg灌胃。10 d后，于最后1次灌药后1 h(灌药前禁食12 h)，乙醚麻醉，颈动脉采血，无菌分离血清，经过56℃，30 min灭活后，置-20℃冰箱保存备用。
       2.2  肿瘤细胞悬液制备 将冻存的人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721按常规方法复苏，接种于含10％小牛血清的DMEM培养液中，传代培养，至细胞呈指数生长期时，弃培养液，加入0.25％胰蛋白酶消化3 min，用DMEM培养液中止消化后弃去，重新加入含10％小牛血清的DMEM培养液吹打，调整细胞数为1×10/ml，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液90 μl。
       2.3  MTT法检测 将培养的细胞接种于96孔的培养板中，置于饱和湿度的CO2培养箱中继续培养24 h（37℃、5％CO2），弃去培养液，然后每孔加入DMEM培养液70 μl，空白组加入不含药的空白兔血清30 μl；阳性药组加入含5-氟尿嘧啶血清30 μl；水龙骨组分3个剂量组：大剂量组加30μl兔含药血清， 中剂量组加20 μl兔含药血清及10 μl的小牛血清，小剂量组加10 μl兔含药血清及20 μl的小牛血清。继续培养24 h，每孔加入MTT溶液，37℃孵育4 h，吸去每孔中的培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)，振荡后采用酶联免疫反应检测仪测定各孔OD值，测定波长为570 nm，调零孔只含有DMSO。所得各孔平均OD值按下述公式计算肿瘤细胞抑制率：抑制率(％)=(对照组平均OD值-给药组平均OD值)/对照组平均OD值×100％。
       2.4  统计学方法  数据以±s表示。进行t检验及方差分析。
       3  结果
       3.1  对人肝癌细胞HepG2的作用 结果表明水龙骨对HepG2有明显的抑制作用，高、中、低浓度含药血清的OD值与空白血清组对照差异均有显著性意义，高浓度含药血清的抑制率可达87.4％，高于5-氟尿嘧啶血清组（见表1）。
       表1  水龙骨对HepG2肝癌细胞的作用（略）
       与空白组比较， **P<0.01，*P<0.05
       3.2  对人肝癌细胞SMMC-7721的作用结果表明水龙骨对SMMC-7721有明显的抑制作用，高、中、低浓度含药血清的OD值与空白组比较差异均有显著性意义，高浓度含药血清的肿瘤细胞抑制率可达85.9％，高于5-氟尿嘧啶血清组(见表2)。
       表2  水龙骨对SMMC-7721肝癌细胞的作用（略）
       与空白组比较，**P<0.01，*P <0.05
       4  讨论
       
       我国是一个肝炎大国，乙型肝炎病毒携带者超过1亿。研究表明乙型肝炎病毒是肝细胞癌变的主要原因［5］，原发性肝癌患者HBV感染率高达89.6％～95％［6］。因此对肝癌的防治应兼顾对乙型肝炎的治疗。水龙骨在民间被广泛用于肝炎的治疗，效果显著，并对肝癌和肝腹水有一定的疗效。本研究采用了血清药理学方法，避免了将中药复方粗提物直接加入反应体系进行实验所得结果的偏倚，从而提高实验结果的可信度。实验结果证实水龙骨在体外能显著抑制肝肿瘤细胞的生长，提示水龙骨是一种很有潜力的抗癌药物，值得更深入地研究。
       【参考文献】
         　　［1］ 中国植物志编委会.中国植物志，第6卷2分册［M］.北京：科技出版社，2000：10.
       
       ［2］ 姚振生，熊耀康，俞 冰，等.浙江省水龙骨科药用植物资源［J］.中药材，2004，27（10）：71８.
       
       ［3］ 核心制药技术公司.水龙骨属提取物的新型治疗用途［J］.国际公布：WO2003/103695 西 2003.12.18.
       
       ［4］ 孟 李，王宁生.含药血清的制备方法研究［J］.中药新药与临床药理，1999，10 (5)：290.
       
       ［5］ Yanyan Zheng, Wen-ling Chen, Stan G.Louie, et a1. Hepatitis B Virus Promotes Hepatocarcinogensis in Transgenic Mice［J］.Hepatology, 2007, 45:16.
       
       ［6］ 陆培新，王金兵，吴一迁，等.乙型肝炎病毒表面抗原携带者队列前瞻性研究在肝癌发生发展中的意义［J］.中华医学杂志，2001，81(14)：856.