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       【摘要】 
       目的建立夜热清颗粒的质量控制方法。方法采用薄层色谱法对处方中的青蒿、牡丹皮、葛根进行鉴别，采用高效液相色谱法测定丹皮酚的含量。结果在选定的薄层色谱条件下，可检出青蒿、牡丹皮、葛根的特征斑点；在选定的高效液相色谱条件下丹皮酚同其它成分达到较好的基线分离，平均回收率为99.16％，RSD为0.82％。结论所建立的方法具有简便、专属、重复性好的特点，能有效地控制该制剂的质量。
       【关键词】  夜热清颗粒； 质量　标准； 薄层色谱； 高效液相色谱； 丹皮酚
       Quality Standard of Yereqing Granule
       DENG Hong, ZHANG Shu, LIN Huaqing,YU Chuqin
       (Institute of Medica, Guangdong Pharmaceutical University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Advanced Drug Delivery, Guangzhou 510006, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish the quality control standard of Yereqing Granule. MethodsHerba Artemisiae Annuae,Cortex Moutan,Radix Puerariae Lobatae were identified by TLC and the content of paeonol was determined by HPLC. ResultsAll components could be detected by TLC.Under the selected HPLC condition, paeonol was well separated from other constituents. The average recovery rate was 99.16%, RSD= 0.82%.  ConclusionThe methods are proved to be simple and special with a good reproducibility and can be used as the quality control of the preparation．
       Key words：Yereqing Granule;  Quality standard;   TLC;  HPLC;   Paeonol
       
       夜热清颗粒为本所在研六类中药新药，由青蒿、鳖甲、牡丹皮、葛根、甘草等中药组成，用于感冒后期低热不退或夜热早凉，术后发热等症。为了控制该制剂的质量，本文对其质量标准进行了实验研究，建立了青蒿、牡丹皮、葛根的薄层鉴别方法和丹皮酚含量的高效液相测定方法，为该药的质量控制提供有效的方法。
       1  仪器与试药
       
       Dionex高效液相色谱仪，P680 HPLC Pump，UVD170U检测器，Chromeleon-HPLC management software；色谱柱为Hypersil ODS2（4.6 mm×150 mm，5 μm，大连依利特分析仪器有限公司）；薄层层析硅胶G，GF254：青岛海洋化工有限公司产品；丹皮酚对照品，中国药品生物制品检定所（供含量测定用，批号：0708－200117）产品；牡丹皮对照药材，购自广州市药材公司产品，产地安徽（经检验符合《中国药典》2005年版一部规定）；青蒿、葛根对照药材，中国药品生物制品检定所产品；夜热清颗粒（自制，批号：040401，040402，040403）；甲醇，色谱纯；水，重蒸水；其他试剂，均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  薄层色谱鉴别
       2.1.1  青蒿的鉴别取本品细粉8 g，加醋酸乙酯20 ml，超声处理30 min，滤过，滤液挥干，残渣用甲醇1 ml溶解，作为供试品溶液；取缺青蒿的阴性样品（按处方去除青蒿，按制备工艺方法制备得）8 g，依法制成阴性对照溶液；另取青蒿对照药材0.8 g，加水20 ml，回流30 min，趁热过滤，滤液加醋酸乙酯提取两次，10 ml/次，合并醋酸乙酯液，水浴挥干，残渣用甲醇1 ml溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法实验［1］，吸取上述3种溶液各2 μl分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-水（5∶2∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，呈相同的亮蓝色荧光斑点，而阴性对照无干扰，见图1。
       2.1.2  牡丹皮的鉴别取本品细粉10 g，加醋酸乙酯20 ml，超声10 min，过滤，滤液水浴挥干，残渣用1 ml丙酮溶解作为供试品溶液；取缺牡丹皮阴性样品（按处方去除牡丹皮,按制备工艺方法制备得）10 g，依法制成阴性对照溶液；另取丹皮对照药材1 g，加水20 ml回流提取30 min，滤液加醋酸乙酯提取两次，10 ml/次，合并醋酸乙酯液，挥干，残渣加丙酮1 ml溶解作为对照药材溶液。照薄层色谱法实验，吸取上述3种溶液各2 μl点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-环己烷（2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以盐酸酸化的5%三氯化铁乙醇液显色，于105℃烘箱加热2～5 min至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材液色谱相应位置上，显相同颜色的蓝褐色斑点，阴性对照未见干扰。见图2。
       图1  青蒿的薄层色谱图（略）     
       图2  牡丹皮的薄层色谱图（略）
       2.1.3  葛根的鉴别取青蒿的鉴别项下的供试液作为供试品溶液；取缺葛根的阴性样品（按处方去除葛根，按制备工艺方法制备得）8 g，依法制成阴性对照溶液；另取葛根对照药材液0.8 g，加水20 ml回流30 min，滤过，滤液加醋酸乙酯提取两次，10 ml/次，合并醋酸乙酯液，水浴挥干，残渣用甲醇0.5 ml溶解作为对照药材液。照薄层色谱法实验，吸取上述3种溶液各2 μl，点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿－醋酸乙酯－甲醇－水（26∶37∶27∶9）为展开剂，展开，取出，晾干，再放回同一展开液中，进行2次展开，取出，晾干，置紫外光下(254 nm)检视。供试品色谱中在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色斑点，阴性对照未见干扰。见图3。
       图3  葛根的薄层色谱图（略）
       2.2  丹皮酚的含量测定
       2.2.1  色谱条件与系统适用性色谱柱为Hypersil ODS2（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为甲醇- 0.7％磷酸 (55∶45)；流速：1.0 ml/min；柱温为室温；检测波长为274 nm；进样量10 μl。在此条件下，理论板数按丹皮酚峰计算高于3 000。
       2.2.2  溶液的制备
       
       对照品溶液制备：精密称取丹皮酚对照品25 mg于50 ml容量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品贮备液；精密量取上述溶液1 ml置于10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（实际配得每ml含48.76 μg的丹皮酚溶液）。
       
       供试品溶液制备：取本品细粉约1 g，精密称定，置100 ml锥形瓶中，精密加入甲醇50 ml，称定，超声处理40 min，放冷，补足减失的重量，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
       
       阴性对照溶液的制备：取牡丹皮阴性样品1 g，精密称定，同“供试品溶液制备”法制成牡丹皮阴性对照溶液。
       2.2.3  专属性的考察在以上色谱条件下,取对照品溶液、阴性对照溶液、样品溶液分别进样10 μl，记录色谱图，见图4。可见阴性对照对测定无干扰。
       图4  高效液相色谱图（略）
       2.2.4  线性关系的考察精密量取丹皮酚对照品贮备液适量于10 ml容量瓶中，加甲醇溶液稀释至刻度，配制成浓度分别为9.752，19.50，39.01，48.76，58.51，68.26，78.02 μg/ml系列对照品溶液，分别进样10μl，测定其峰面积，以对照品浓度C（μg/ml）为横坐标,峰面积A为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为：A=0.698 3C-0.280 1，r=0.999 8。结果表明丹皮酚在9.752～78.02 μg/ml的范围内浓度与峰面积有良好的线性关系。
       2.2.5  精密度实验精密量取上述供试品溶液10 μl， 重复进样6次, 记录丹皮酚峰面积，计算RSD为0.96%。结果表明本法精密度好。
       2.2.6   重复性实验取同一供试品（批号040401），按供试品制备方法制备6份供试品溶液，并按上述方法测定含量，结果丹皮酚平均含量为2.278 mg/g，RSD为0.37%。表明本法重复性好。
       2.2.7  稳定性实验取上述重复性实验一份样品，分别于0， 2，4，6，8 h依法测定，结果表明，供试品溶液在8 h内稳定性良好，RSD为2.60％ 。
       2.2.8   加样回收率实验精密称取已知含量样品约0.4，0.5，0.6 g各3份(含量为2.278 mg/g)，分别精密加入浓度分别为0.097 52，0.1219，0.1463 mg/ml的丹皮酚对照品溶液各10   ml，然后精密加入甲醇40 ml，依法测定，计算回收率，结果表明，本法具有良好的回收率。结果见表1。
       表1  回收率实验测定结果（略）
       2.2.9  样品测定取3批自制样品，按供试品溶液制备方法制备，依法测定，计算样品中丹皮酚的含量。结果见表2。
       表2  每袋样品含量测定结果（略）
       3  讨论
       
       青蒿为本方君药，其化学成分分为四类：挥发油、倍半萜、黄酮和香豆素［2］，曾以青蒿素为定量指标，参考文献［3］进行测定，结果样品中青蒿素的含量几乎检测不到，究其原因，可能是由于青蒿素几乎不溶于水，而本品采用水提工艺（以药效试验为指标筛选而得），因此，另选青蒿的其它成分作为鉴别项目，根据香豆素类成分在紫外光（365 nm）下显蓝色荧光［4］，可在薄层板上鉴别出青蒿中香豆素类成分的存在，而青蒿的定量指标仍有待继续研究。
       
       夜热清颗粒中丹皮酚易于挥发，为保证药品质量，选用该成分作为定量指标。参考文献［5～8］，丹皮酚多采用甲醇-水（调节pH）作为流动相，经实验，确定流动相为：甲醇-水 （含0.7％磷酸）(55∶45)，样品峰形对称，理论板数按丹皮酚峰计算不低于2 000。丹皮酚阴性样品溶液在相同色谱条件下未见干扰色谱峰。
       
       含量测定供试品溶液的制备考察了提取方法和提取时间。选择用甲醇提取丹皮酚，对加热回流、超声处理两种方法进行了比较，结果加热回流、超声提取所得丹皮酚含量分别为2.115，2.173 mg/g，两种方法所得结果较为接近，RSD＜3%，因超声提取较为方便，同时重复性好，故采用超声方法提取；考察超声提取20，30，40，50 min所得丹皮酚含量分别为1.827，2.082，2.265，2.278 mg/g，故认为超声提取40 min丹皮酚已提取完全。
       
       本文建立的方法简便、专属、重复性好，能有效控制该制剂的质量。含量限度有待进一步考察。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录31.
       
       ［2］ 杨 云，张 晶，陈玉婷，等.天然产物化学成分提取分离手册［M］.北京：中国中医药出版社，2003：439.
       
       ［3］ 汪文来. HPLC法测定类风湿胶囊中青蒿素的含量［J］.中国中医基础医学杂志，2003，12（9）：43.
       
       ［4］ 卢艳花，魏东芝，蒋晓萌，等.中药有效成分提取分离技术［M］.北京：化学工业出版社，2005：218.
       
       ［5］ 陈文芳.HPLC测定丹皮酚软膏(丹皮酚霜)中丹皮酚的含量［J］.药物分析杂志，2007，27(5)：769.
       
       ［6］ 王海丽.HPLC测定骨刺消痛胶囊中丹皮酚的含量［J］.中成药，2006，28（5）：771.
       
       ［7］ 钟兆健，傅 军，陈晓颖. HPLC法测定妇炎宁合剂中丹皮酚的含量［J］.中药材，2005， 28（7）：610.
       
       ［8］ 何 群 ，刘平安，赵碧清，等. HPLC法测定愈痫灵颗粒中丹皮酚的含量［J］.中国药房，2007，18（15）：1154.