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       【摘要】 
       目的探讨夜香树不同提取物对小鼠白血病细胞株L1210细胞的增殖抑制作用及机制。方法采用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法、平板集落法和Hoechst33258荧光染色法观察夜香树提取物对L1210细胞的生长抑制和凋亡的影响。结果夜香树提取物中正丁醇提取物和多糖提取物对L1210细胞有浓度依赖性的细胞毒性作用，在终浓度为62.5 μg·ml-1范围，其正丁醇提取物和多糖提取物对L1210细胞的抑制率大于90%，IC50均小于10 μg·ml-1，夜香树正丁醇和多糖提取物能抑制L1210细胞集落形成，并可诱导L1210细胞发生凋亡。结论夜香树提取物对小鼠白血病细胞株L1210细胞的增殖抑制可能通过诱导L1210细胞发生凋亡而发挥作用。
       【关键词】  夜香树提取物； 小鼠白血病细胞； 细胞增殖； 集落形成
       Inhibitory Effect of  Extracts  from  Cestrum  nocturnum Linn. on Proliferation of Leukemic L1210 Cells
       LUO Fajun, ZHONG Zhenguo, ZHAO Huaping,ZHAO Shiyuan*
       （Daxin County People"s Hospital, Guangxi 532300, China ;New Drug Development Center of  University of Traditional Chinese Medicine，Nanning, Guangxi 530001,China;Guangxi Nationality"s Hospital, Nanning, Guangxi 530001, China）
       Abstract：ObjectiveTo evaluate the inhibitory effect of different extracts  from  Cestrum  nocturnum Linn..(CN)  on mouse leukcmic L1210 cells and explore its mechanism. MethodsThe MTT assay, colony forming experiment and Hoechst 33258 fluorescence measurement were used to analyze the effect of extracts  from  CN on leukcmic L1210 cells. ResultsThe n-bulty alcohol part and polysaccharide part extracted from CN had dose-dependent effects of cytotoxicity.When the concentration was 62.5 μg·ml-1, the inhibitory rate of cells growth was above 90% and the IC50 was below 10 μg·ml-1.The inhibitory rate of cells had remarkable dose-dependence. They both could inhibit colony information and induce apoptosis of L1210 cells. ConclusionThe inhibitory effect of extracts  from  CN.on leukemic L1210 cells prolifertion may be related with apoptosis.
       Key words：Extracts  from  Cestrum  nocturnum Linn.；  Leukemic；   Proliferation；  Colony forming
       
       夜香树，又名夜来香，茄科属植物Cestrum  nocturnum Linn.，文献报道夜香树提取物有抗实验心率失常局部麻醉和中枢抑制作用［1，2］。课题组将夜香树（以下简称CN）叶及嫩枝用乙醇进行渗漉提取后，浸膏以系统溶剂分离进行部位分离，得到CN提取物，体外培养小鼠白血病L1210细胞，观察不同浓度的CN提取物对其抑制作用，初步探讨其抑制作用的机制。现报道如下。
       1  材料和方法
       1.1  药物 CN叶及嫩枝采自广西境内，经本院药用植物教研室刘寿养教授鉴定为茄科属植物夜香树Cestrum  nocturnum Linn.。
       1.2  受试药物的提取及配制CN叶及嫩枝经日晒干燥后，采用渗漉法得乙醇浸膏，浸膏用硅胶拌匀后，依次用石油醚，醋酸乙酯，水饱和正丁醇，然后用95%乙醇和50%乙醇等回流提取，回收溶剂，得CN石油醚部位、 CN醋酸乙酯部位、CN正丁醇部位、CN多糖部位。CN正丁醇部位和CN多糖部位分别用生理盐水注射液配制成5 mg·ml-1，G6漏斗滤过除菌，4℃冰箱内保存备用。
       1.3  细胞培养  L1210细胞系小鼠淋巴细胞白血病细胞，购自上海细胞生物研究所细胞库。将L1210细胞接种于DAB/2小鼠腹腔内，传代保种。临用时处死小鼠抽取腹水，离心收集细胞，经洗涤后用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液进行培养，在含5%CO2的37℃温箱中培养，每3 d传代1次。
       1.4  MTT比色法［3］检测CN提取物对小鼠白血病L1210细胞增殖的影响取对数生长期的L1210细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养液配成1×104·ml-1，接种在96孔培养板中，每孔200 μl，每组设4个平行孔。置37℃，10%CO2培养箱中培养24 h后, 离心弃上清，实验组分别加入最终浓度为62.5，31.25，15.62，7.81，3.90 μg·ml-1的CN提取物的培养液，正丁醇部位以及多糖部位的对照组则加入等体积溶剂的培养液，而石油醚部和醋酸乙酯部另设DMSO空白对照，加入等体积含DMSO的培养液；置37℃，10% CO2培养箱培养3 d后弃去上清液，加入200 μl /孔新鲜配制的含0. 2 mg·ml-1 MTT的无血清培养液，37℃继续培养4 h，弃去上清液，加入200μl /孔 DMSO，振荡混匀后，在酶标仪上以波长为550 nm，参比波长为450 nm测定OD值，测定时减去空白对照。实验重复4次。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。
       
       肿瘤细胞生长抑制率%=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值) ×100%。
       1.5  集落形成实验   取对数生长期的L1210细胞，用培养液配成每1 000/ml的细胞悬液，实验组分别加入不同浓度的CN提取物 (62.5，31.25，15.62，7.81 μg·ml-1和3.90 μg·ml-1)，对照组加入等体积的溶剂。取已融化的5%琼脂液1份，加入到9份37℃含10%胎牛血清的培养液中，加入到平皿，每个1ml,置室温凝固。取预温细胞按每9.4 ml加5%琼脂0.6 ml混匀，加到已铺底层琼脂平皿中，每个1 ml。置10 % CO2，37℃条件下培养7 d。在倒置显微镜下计数含50个细胞以上的集落数，计算集落形成抑制率：集落形成抑制率（%）=(1-给药组集落数/对照组集落数)×100%。
       1.6  Hoechst 33258染色法 将L1210细胞接种于10%胎牛血清的培养基中，加96孔培养板中，每孔200 μl。实验组分别加入不同浓度的CN提取物，对照组加入等体积溶剂。置10%CO2，37 ℃培养72 h后，每孔取100 μl细胞悬液，加2 mmol·L-1Hoechst 33258 1 μl，37℃染色15 min，取40 μl滴到干净的玻片上，加盖玻片，在荧光显微镜下观察(40×)，随机计数300个细胞，计算细胞凋亡率。实验重复3次。
       1.7  统计学处理 实验数据用±s，数据统计分析采用SPSS 10.0统计软件进行统计学处理，组间比较用t检验。
       2  结果
       2.1  CN提取物对小鼠白血病L1210细胞的毒性作用将浓度不同的CN提取物作用于体外培养的小鼠白血病L1210细胞72 h。结果见表1。
       表1  CN不同提取物用MTT法对小鼠白血病L1210细胞的抑制作用（略）
       *P＜0.05；**P＜0.01vs compared with the negative control group
           
       从表1可以看出，醋酸乙酯部位对白血病细胞株L1210的抑制作用较弱，而石油醚部位对白血病细胞株L1210有一定的抑制作用，IC50为21.35 μg·ml-1，CN正丁醇部位、CN多糖部位对L1210细胞有很强的抑制率作用，IC50分别为6.97 μg·ml-1，5.85 μg·ml-1；阳性对照As2O3的IC50分别为13.40 μg·ml-1。
       2.2  CN提取物对小鼠白血病L1210细胞集落形成的抑制作用  CN正丁醇部位及CN多糖部位不同浓度对L1210细胞集落形成，用As2O3 作阳性对照。结果见表2。
       表2  CN提取物不同浓度对肿瘤细胞株集落形成的影响（略）
       *P＜0.05；**P＜0.01vs compared with the negative control group；n=10
       
       表2结果显示，CN正丁醇部位、多糖部位的3个实验剂量组对L1210细胞的集落形成均有不同程度的影响，各剂量组与阴性对照组均有显著的差异。
       2.3  CN提取物对小鼠白血病L1210细胞凋亡的影响用不同浓度的CN正丁醇部位、CN多糖部位处理L1210细胞72 h，用Hoechst 33258染色后，在荧光显微镜下可见凋亡细胞，细胞强蓝色荧光，弱红色荧光，在终浓度为15.62 μg·ml-1，CN正丁醇部位、CN多糖部位、阳性对照组对L1210细胞凋亡率分别为（46.26±3. 80）%，（52.21±5.31）%，（56.12±3. 9）%， L1210细胞自然凋亡率为（10.36±1.7）%。在15.62 μg·ml-1范围，CN正丁醇部位、CN多糖部位对L1210细胞凋亡率与阴性对照组相比较有显著性差异（P<0.01）。
       3  讨论
       
       白血病是造血系统的恶性肿瘤，占癌肿总发病率的5%左右，是儿童和青少年最常见的一种恶性肿瘤。目前白血病的治疗大多以化疗为主，其作用是全身性的，毒副作用较强，因此，寻找高效低毒、抗瘤谱广、综合性能又好的植物来源的抗癌药是现在研究的重点。
       
       体外抗肿瘤实验为抗肿瘤药物筛选过程必不可少的部分。利用体外肿瘤细胞培养和MTT法，以抑制肿瘤细胞增殖为活性指标，是目前一种快速、经济、简便、有一定特异性的药物筛选方法，在MTT法实验基础上采用集落形成能力试验、细胞计数、蛋白质或其他大分子物质含量测定，能客观地反映被测物质的药理作用。通过此方法，不仅可以发现有效的抗肿瘤药物，而且还可以从细胞水平和分子水平对抗肿瘤机制进行研究［4，5］。
       
       本研究中，细胞毒试验（MTT法）实验结果显示，CN不同提取物对L1210细胞都有不同程度的抑制作用，且其抑制作用呈明显的剂量关系。其中CN正丁醇部位、CN多糖部位对L1210细胞的半数致死浓度（IC50）<20 μg·ml-1，符合体外抗肿瘤疗效评价规定［6］：植物粗提物的IC50小于20 μg/ml时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用。集落形成实验表明，集落形成抑制率随着CN提取物剂量的增加而增大，说明CN提取物能降低L1210细胞恶性程度，而Hoechst 33258染色法实验进一步佐证CN提取物抗L1210细胞增殖作用，并初步证明CN提取物对L1210细胞的抑制作用可能通过诱导细胞发生凋亡来实现的。
       【参考文献】
         　　［1］ 曾 靖，黄贤华，赖 飞，等.夜来香水提取液局部麻醉作用［J］.赣南医学院学报，2003，23（1）：1.
       
       ［2］ 曾 靖，李坊贞，叶和杨，等.夜来香正丁醇提取物的中枢抑制作用［J］.赣南医学院学报，2003，23（3）：237.
       
       ［3］ Weitman S, Barrera H, Moora R, et al. Augumentation of antitumor activity when combined with topotecan［J］. J Pediatr Hematol Oncol, 2000, 22(4):306.
       
       ［4］ Lemaire M, Momparler LF, Farinha NJ,et al.Enhancement of antineoplastic action of 5-aza-2"-deoxycytidine by phenylbutyrate on L1210 leukemic cells［J］.leuk lymphoma,2004,45(1):147.
       
       ［5］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学,第3版［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1757.
       
       ［6］ 韩 锐.抗癌药物研究与实验技术［M］.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1997：271.