文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的通过观察小鼠心肌细胞凋亡因子Fas/FasL蛋白表达的水平，探讨益气养阴、活血化淤方的作用机制及 Fas/FasL系统在细胞凋亡中的重要作用。方法210只Balb/c小鼠，随机分为4组。空白对照组30只；模型组、中药高剂量组、中药低剂量组各60只，采用多次接种柯萨奇B3m病毒的方式，建立重复感染的早期病毒性扩张型心肌病动物模型, 中药高剂量组、中药低剂量组用益气养阴、活血化淤方治疗，于治疗4周后观测小鼠心肌病理形态学改变，免疫组化方法检测Fas/FasL蛋白表达。结果模型组心肌组织中Fas/FasL蛋白的阳性表达较空白组增多(P<0. 05)，中药高剂量组和中药低剂量组较模型组显著降低(P<0. 05)。结论益气养阴，活血化淤方能够下调扩张型心肌病小鼠Fas/FasL蛋白表达，对心肌细胞起到保护作用。
       【关键词】  益气养阴，活血化淤方； 扩张型心肌病； Fas/Fasl蛋白； 细胞凋亡； 柯萨奇病毒B3m
       Effect of the Prescription of YiQiYangYin HuoXueHuaYu on the Expression of Myocardial Fas/Fasl Protein in Viral Ditated Cardiomyopathy Mice
       GAO Yunji, ZHOU Yabin*, ZHANG Zhanjun, ZHANG Lili
       (Heilongjiang University of TCM,Haerbin 150040, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of the prescription of Yi Qi Yang Yin Huo Xue Hua Yu on the expression of myocardial Fas/Fasl protein in viral ditated cardiomyopath mice.Methods210 Balb/c mice were randomly divided into 4 groups: blank group,model group, high dose traditional Chinese medicine group and low dose traditional Chinese medicine group. The mice of blank group were given relative dilute solution.The others were injected the CVB3m virus to the peritoneal cavity to set up the animal model of the viral dilated cardiomyopathy.Then the relative medicine was given for 30 days after 3 months.The immunohistochemical method was used to detect the expression of Fas/ FasL protein in cardiac muscle.ResultsThe expression of Fas/ FasL protein in cardiac muscle in model group was higher than that in blank group. The expression of Fas/ FasL protein in cardiac muscle in high dose traditional Chinese medicine group and low dose traditional Chinese medicine group were significantly lower than that in model group.There was no significant difference between the high dose traditional Chinese medicine group and low dose traditional Chinese medicine group.ConclusionThe prescription of Yi Qi Yang Yin Huo Xue Hua Yu can inhibit apoptosis of myocardial cells.The mechanism is that the prescription of Yi Qi Yang Yin Huo Xue Hua Yu can protect the cardiac muscle by reducing the expression of Fas/ FasL protein .
       Key words:Prescription of Yi Qi Yang Yin Huo Xue Hua Yu；  Dilated cardiomyopathy；  Fas/Fasl protein；  Apoptosis of myocardial cells；  CVB3m
       
       大量的实验研究已经证明Fas/Fasl介导的细胞凋亡参与了急性期病毒性心肌炎的发病，但是否参与了慢性期的发病，研究甚少［1］。目前的观点认为病毒性心肌炎是扩张型心肌病的前驱表现，而扩张型心肌病则是病毒性心肌炎的终末期表现。尽管许多问题尚未明确，但病毒感染免疫反应是扩张型心肌病的主要发病原因［2］。由于目前对于病毒的预防尚无特效的防治方法（如2003年SARS冠状病毒），所以对其治疗并防止进一步发展意义重大。益气养阴、活血化淤方是导师经过多年的临床经验总结出来的、治疗病毒性心肌炎终末阶段的方剂，本研究主要是探讨其对细胞凋亡因子Fas/FasL蛋白的影响。
       1  材料
       1.1  动物3～4周龄雄性Balb/c小鼠210只，体重约10 g，购自北京军事医学科学院实验动物中心（动物合格证号：SCXK-军）。
       1.2  病毒柯萨奇B3m病毒(Nancy株，哈尔滨医科大学克山病研究所提供)，在Hela细胞中传代，冻融3次，离心（2 000 r/min）10 min，上清液分装，在Hela细胞中测50%组织感染率（TCID50）为10-7,-70℃保存备用。
       1.3  药材益气养阴、活血化淤方：由黄芪、红参、生地、麦冬、五味子、川芎、丹参、板蓝根、大青叶等药物组成。中药经水提取，制成浸膏，含水量为21％。用蒸馏水稀释，调整浓度为82％，即相当于每毫升悬液中含生药4.3 g，备用（黑龙江中医药大学制剂室提供）。
       1.4  试剂抗FasL抗体,抗Fasl抗体均为兔IgG多抗、SABC试剂盒、DAB显色液，均购自武汉博士德生物工程有限公司。
       2  方法
       2.1  模型制备及分组210只3～4周龄雄性Balb/c小鼠，适应性喂养1周后，随机分为4组。空白组30只；模型组、中药高剂量组、中药低剂量组各60只。模型制备：模型组、中药高剂量组及中药低剂量药组分别于实验的第1，8，15，22，36，50天给予腹腔注射RPMI 1640液稀释的0.1 ml 10-4 TCID50 CVB3m及0.1 ，0.2，0.1，0.1，0.1 ml 10-3 TCID50 CVB3m。空白对照组6次均给予等量的RPMI1640液。
       2.2  给药方法及取材各组均于末次病毒注射后10 d，即实验的第60天开始灌胃。中药高剂量组、中药低剂量组分别给予益气养阴、活血化淤方混悬液灌胃，中药低剂量组10.35 g/（kg·d），中药高剂量组20.7 g/（kg·d），以上给药剂量均为生药量。模型组和空白组灌以同体积蒸馏水，灌胃1次/d，连续4周。实验结束时，用电子天平上称取小鼠体重，无菌解剖取出心脏,滤纸吸干水分称重后,沿左室长轴剪为两份。一份置4％多聚甲醛中固定，一份置3％戊二醛中固定。
       2.3  免疫组化检测Fas/FasL蛋白表达采用SABC法测定Fas/FasL蛋白表达，按照SABC试剂盒说明书操作Motic images advanced 3.2彩色病理图像分析系统进行计算机图像分析。
       2.4  统计学方法应用SPSS13.0 for Windows统计软件进行统计分析。计量资料应用±s表示，多组均数间的比较应用方差分析，两两比较应用q检验。
       3  结果
       3.1   小鼠死亡率见表1。
       表1  各组小鼠死亡率的比较（略）
       与空白组比较， ▲P<0.05；与模型组比较，△P>0.05
       
       模型组、中药高剂量组、中药低剂量组分别死亡27，31，21只。各组小鼠的总死亡率与空白组相比均有显著性差异（P<0.05），而中药高、低剂量组与模型组相比，小鼠死亡率无明显差异（P>0.05）。
       3.2   小鼠体重、心脏质量指数变化
       3.2.1  小鼠体重变化见表2。
       表2  小鼠体重变化的比较（略）
       与空白组比较，▲P<0.05；与模型组比较，△P<0.05
       
       以上结果表明，与空白组相比，各组小鼠体重均有明显下降（P<0.05）；与模型组相比，中药高剂量组和中药低剂量组小鼠体重均有明显增加（P<0.05）。
       3.2.2  小鼠心脏质量指数变化见表3。
       表3  小鼠心脏质量指数变化的比较（略）
       与正常对照组比较，▲P<0.05，*P>0.05；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
       
       以上结果表明，与空白组相比，模型组及中药低剂量组小鼠心脏/体重比值均明显增高（P<0.05），而中药高剂量组与正常组相比也有增高，但无统计学意义(P>0.05)；与模型组相比，中药高剂量组和中药低剂量组小鼠心脏/体重比值均明显降低，其中尤以中药高剂量组明显（P<0.01）。
       3.3  小鼠心肌组织病理形态学改变空白组小鼠心肌组织结构正常。光镜下模型组小鼠心肌纤维排列紊乱、断裂，心肌细胞肥大，空泡变性，血管充血出血，少量炎细胞浸润，间质纤维化明显。电镜下模型组小鼠心肌超微结构表现为心肌细胞核变大，可见双核仁，核膜明显不规则，线粒体明显增多，增生的线粒体嵴为板层体，同时也可见线粒体嵴融合，肌节结构不清，肌丝溶解、断裂，M线消失，间质胶原纤维增生明显，间质纤维母细胞增生活跃。中药高低剂量组小鼠心肌组织结构改变均较模型组轻微。见图1。
       3.4  小鼠细胞凋亡因子Fas/FasL蛋白表达的影响石蜡切片经两步法免疫组化染色后,Fas/FasL蛋白阳性染色成棕黄色颗粒,位于细胞膜或胞浆内,在中药组和模型组心肌组织内均可检测到Fas/FasL蛋白的阳性表达,用图像分析系统检测目标面积占选区面积的百分比，结果见表4；阳性细胞的光密度（见表5）；模型组心肌组织中Fas/FasL蛋白的阳性表达较空白组增多(P<0.05),中药低剂量组和中药高剂量组较模型组显著降低(P<0.05),中药低剂量组与中药高剂量组之间无显著差异（P>0.05）。见图2。
       图1  实验鼠心肌组织病理形态学改变（略）
       图2  实验鼠心肌细胞Fas/FasL蛋白的表达（略）
       表4  各组Fas/FasL目标面积占选区面积的百分比的比较（略）
       与空白组比较，△P<0.05；与模型组比较，*P<0.05；与中药高剂量组比较，▲P<0.05
       表5  各组Fas/FasL阳性细胞平均光密度的比较（略）
       与空白组比较，△P<0.05 ,与模型组比较，*P<0.05,与中药高剂量组比较，▲P<0.05
       
       4  讨论
       
       Fas/FasL是一柄双刃剑，如果该系统被适当地调节，可以清除病毒感染细胞；如果调节不当，也可导致组织损伤［3］。动物实验和实体研究均已证实病毒性心肌炎中存在着Fas/FasL的异常表达［4］，并在心肌损伤中起重要的作用［5］。但Fas/FasL诱导心肌细胞及外周淋巴细胞凋亡是宿主为了限制病毒清除感染细胞的一种防御措施，还是通过Fas/FasL作用激发未感染细胞凋亡从而损伤心肌，引起免疫功能低下，亦或感染不同时期Fas/FasL所起作用不同，尚不清楚。但因为心肌细胞是一种高度分化、接近分化末端的、再生能力很低的组织细胞，过多的心肌细胞凋亡即使是宿主防御的结果，也会使心肌细胞减少从而影响心肌收缩功能，最终发展成扩张型心肌病。因此，这一系统的具体作用机制及如何利用该系统来治疗病毒性心肌炎的持续心肌损伤及发展而成的扩张型心肌病，值得人们关注。
       
       祖国医药从“整体出发，辨证论治”发挥“治病求本”的思想，以“阴阳平衡”为目标，导师经过多年临床经验针对在慢性病毒性心肌炎向扩张性心肌病过渡的这一阶段，进行辨证论治总结病例，自拟益气养阴、活血化淤方，治疗扩张型心肌病，达到调节阴阳平衡之目的，临床有较好疗效。通过动物实验证明，本方有可能是利用了Fas/FasL这一系统来治疗病毒性心肌炎的持续心肌损伤及发展成的扩张型心肌病。
       
       个体的稳态不仅需要生理和生化过程的平衡，也必须具有组织形态和稳定，而细胞凋亡则是确保这一稳态不可缺少的细胞学基础［2］。本研究观察到模型组Fas/FasL蛋白阳性表达增加，Fas/FasL被认为是与细胞凋亡密切相关的基因，当FasL与Fas结合后，Fas向细胞内传导凋亡信号而致Fas表达细胞凋亡［6，7］。本研究发现，Fas/FasL蛋白表达的分布与心肌细胞凋亡的分布趋势一致，说明Fas/FasL蛋白表达与心肌细胞凋亡之间的密切关系，表明Fas/FasL在扩张型心肌病心肌细胞凋亡中有重要意义。
       
       本研究结果提示，Fas/FasL介导的细胞凋亡参与了慢性病毒性心肌炎及发展成扩张心肌病的发病，中药组具有减少慢性期病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的作用，其减少心肌细胞凋亡的机制，可能是利用了Fas/FasL这一系统来治疗病毒性心肌炎的持续心肌损伤及发展成的扩张型心肌病。
       【参考文献】
         　　［1］ 韩 波，马沛然，刘 芳，等.细胞凋亡和Fas/FasL基因在小鼠病毒性心肌炎发病中的作用［J］.中华儿科杂志，2000，38(7)：405.
       
       ［2］ 林文棠， 朱 平.实用临床免疫学［M］.西安：第四军医大学出版社，2003：298.
       
       ［3］ 胡 野， 凌志强， 单小云.细胞凋亡的分子医学［M］.北京：军事医学出版社，2002：400.
       
       ［4］ Toyozaki T,Hiroe M,Tanaka M. Levels of soluble Fas ligand in［J］.Am J Cardio,1998,82(2):246.
       
       ［5］ Seko Y,Kayagaki N,Semo K,et al,Role of Fas/Fasl pathway in the activation of infiltrating cells in murine acute myocarditis caused by Coxsackievnis B3［J］.J Am Coll Cardiol,2002,39(8)：1399.
       
       ［6］ French LE Fas and Fas ligand in embryos and adult mice;ligand expression seveval immune-privileged tissue and coexpression in turnover［J］.J Cell Biol 1996，133(2)：335.
       
       ［7］ Lynch DH,Ramsdell F, AldersonMR,et al.Fas and Fasl in the homeostatic regulation of immune responses［J］.Immunol Today，1995,16(2)：569.