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       【关键词】  乌龙丹
       摘要：目的：建立乌龙丹的质量控制方法。方法：应用TLC法对首乌、黄芪进行定性鉴别，应用高效液相色谱法测定葛根素的含量。色谱条件：流速1 ml/min，流动相：甲醇∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸20∶4∶76，检测波长：250 nm。结果：薄层色谱定性方法简便、灵敏、专属性强；葛根素在0.052 5～0.735 μg范围之内呈良好的线性关系，r=0.999 5。平均回收率99.18%，RSD=1.55%。结论：此法简便、准确，可有效控制产品质量。
       关键词：乌龙丹；首乌；黄芪；TLC；葛根素； 
 
　　Quality Standard of Wulongdan Liquid Extract
       GUO Jiansheng， SHEN Qun， WANG Xiaogen， PENG Kang，ZANG Kuntang
       (1.The Department of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University,Guangzhou 510515, China； 2.Guangdong Professional Institute of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Guangzhou 510500, China)
       Abstract:Objective:To build up the quality control method for Wulongdan Liquid Extract.Methods:Qualitative determination of Radix Pueriae and Radix Polygoni Multiflori.Puerarin was carried out by HPLC. The mobile phase was ethanol-acetonitrile-0.025 mol/L phosphoric acid(20∶4∶76)at a flow of 1.0ml／min,and detection wavelength was 250nm.Results:TLC qualitative methods were simple，sensitive and specific，the determination method for puerarin had a good linear relationship in the range of 0.052 5～0.735 μg，r=0.999 5.The average recovery was 99.18%，RSD=1.55%.Conclusion:This method is simple,accurate and can be used as the standards for quality control of this product.
       Key words:Wulongdan Liquid Extract;Ruerice; Radix Polygoni Multiflori;TLC; Puerin;HPLC
                       
　　乌龙丹系国家级名老中医臧堂教授临床经验方，由黄芪、首乌、葛根、地龙、丹参、川芎等多味中药组成，有益气活血、补肾填髓、化瘀通络等功效，主要用于治疗缺血性脑病，如脑梗塞、脑栓塞、短暂性脑缺血发作、脑出血恢复期、脑动脉硬化、脑萎缩及高血压头晕头痛、颈椎病（椎-基底动脉供血不足型）、颅脑外伤或手术后遗症等病证。为了控制该药品的内在质量，确保用药安全有效，本文参照有关文献方法［1～3］，建立TLC法对首乌、黄芪进行定性鉴别，采用高效液色谱对该制剂中主要成分葛根素进行含量测定的方法，为控制本品质量打下基础。
       　1 材料与仪器
       乌龙丹流浸膏及各阴性对照品：自制。葛根素对照品（编号：0752-200108），大黄素对照品（编号：0756-200211），黄芪甲苷对照品（编号：0781-200109）；以上对照品和对照药材均由中国药品生物制品检定所提供；硅胶G和（青岛海洋化工厂）所用试剂甲醇和乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。HP1100（美国惠普）高效液相色谱仪。自动进样器，DAD紫外检测器。
       　2 方法与结果
       2.1 首乌薄层色谱鉴别取乌龙丹浸膏10 ml(1 ml浸膏≈2.5 g原药材），置250 ml圆底烧瓶中，加甲醇60 ml，水浴加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，加稀硫酸30 ml，沸水浴中水解30 min，放冷，置分液漏斗中，加乙醚提取2次，30 ml/次，合并提取液，加水洗涤2次，每次10 ml，弃去，乙醚液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液，另取首乌对照药材2.7 g，同法制成对照药材溶液。同法制成缺首乌的阴性对照溶液。另取大黄素对照品，加氯仿制1 ml含0.75 mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法［4］实验，吸取供试品溶液及对照药材溶液15 μl，对照品溶液5 μl，阴性对照溶液15 μl ，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以正己烷醋酸乙酯甲酸(15∶7∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干。置365nm紫外光下观察，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。见图l。
       2.2 黄芪薄层色谱鉴别取乌龙丹浸膏10 ml加甲醇100 ml摇匀后滤过，滤液置水浴上蒸干，残渣加水30 ml溶解，移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次，30 ml/次，合并正丁醇提取液，用氨水提取3次，20 ml/次。弃去氨液，正丁醇液用正丁醇液饱和的水提取3次，30 ml/次，弃去水液，正丁醇液置水浴上蒸干，残渣加甲醇5 ml溶解，通过D101型大孔树脂柱(内径2 cm，长10～12cm)，以水100 ml洗脱，弃去水液。再用40%乙醇150 m1洗脱，弃去40%乙醇洗脱液，继续用70%乙醇200 ml，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇，溶解并移至2 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。同法制成缺黄芪的阴性对照液。称取黄芪对照药材3 g加入100 ml甲醇回流提取后同法制成对照药材溶液，另取黄芪甲苷对照品加甲醇制成l mg/ml的对照品溶液。照薄层色谱法［4］实验，吸取供试品溶液15 μl，对照药材溶液和对照品溶液2 μl，阴性对照溶液l0 μl，分别点于同一硅胶G薄层板，以氯仿甲醇水(13∶6∶2)(10℃下放置过夜)的下层溶液为展开剂，展开约l0 cm，取出，晾干，喷以10% 硫酸乙醇溶液，在l00℃烘约3 min至斑点显色清晰，供试品和阳性对照液与对照品色谱相应的位置上显相同的斑点，且阴性对照无干扰。见图2。
       2.3 HPLC测定葛根素含量
       2.3.1 葛根素对照品溶液的制备精密称取葛根素对照品适量，加甲醇配成每毫升含0.1 mg的对照品溶液。
       2.3.2 样品溶液的制备精密称取乌龙丹流浸膏0.5 g于25 ml容量瓶中，定容，以0.45 μm微孔滤膜滤过作为供试品。
       2.3.3 缺葛根阴性溶液的制备取缺葛根样品，按样品溶液的制备方法制成葛根阴性溶液。
       2.3.4 色谱条件色谱柱：Akzonobel ODS柱(250 mm×4.6 mm)，流动相:甲醇∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸20∶4∶76，流速：1 ml/min，检测波长：250 nm。在此色谱条件下，取葛根素对照品溶液、供试品溶液、缺葛根阴性对照品溶液各5 μl，进行HPLC测定。结果见图3～5。可见与对照品保留时间一致，并且葛根素与其他组分达到较好地分离。而阴性未出现该峰，不干扰此成分的测定。
       2.2.5 葛根素线性关系考察配制葛根素对照品溶液0.105 mg/ml，以自动进样器分别进样0.5,1,2,3,4,5,7 μl，测定峰面积，并以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归，得标准曲线方程：A=3 914.4C＋112.32，r=0.999 5。结果表明，在0.052 5～0.735 μg范围内，葛根素峰面积值与进样量有良好的线性关系。
       2.2.6 精密度实验精密吸取对照品溶液5 μ1，重复进样5次，葛根素峰面积的RSD为1.66%，结果表明精密度良好。
       2.2.7 重现性实验按前文所述“含量测定”方法，对同一批样品，分别制备5份供试品溶液，各吸取5 μl进行HPLC法测定，结果葛根素含量为0.138 2%，RSD=1.59%。表明本法重现性良好。
       2.2.8 稳定性实验按拟定含量测定方法，制各样品供试液，并于0，1，2，4，6，8 h 测定峰面积值，结果其RSD为 1.51%，结果表明样品液在8 h内稳定。
       2.2.9 回收率实验精密称取同一批号样品，共5份，各精密加入葛根素对照品(0.105 mg/ml)7 ml，照供试液制备方法制得供试液，并按以上色谱法进行测定，计算回收率，平均回收率99.18%，RSD=1.55%，数据结果见表1。结果表明，本法回收率高。表1 回收率实验结果（略）                   
　　2.2.10 样品的测定及最低限量的确定按上述测定方法，对五批样品进行了葛根素的含量测定，结果见表2。表2 五批样品的测定结果（略）
       根据上述测定结果，暂定本品每克含葛根素不少于1.36 mg；n=3
       3 讨论
       乌龙丹系我校臧堂教授拟制的治疗缺血性脑病临床经验方，在多年的临床实践中验证该方对治疗缺血性脑病具有确切的良好疗效，为推广其用，拟将其研制成中药新药，本文在该制剂的质量标准控制方面做了大量的工作。首乌、黄芪药材的TLC鉴别和中药复方中葛根素含量测定已有文献报道，本实验通过对乌龙丹中的薄层色谱分析可鉴别出首乌、黄芪药材，文献报道［5］对黄芪皂苷的几种提取分离方法如水提法、醇提法、萃取法精制、树脂吸附法精制和超临界CO2法，本文采用超声提取法，使方法更加简便，斑点清晰，阴性无干扰，重现性好，专属性强，可作为该制剂的定性指标：本实验同时对方中葛根的有效成分葛根素含量进行定量，但由于制剂中葛根素采用水提取工艺可能影响葛根素的提取率，因此该制剂的提取工艺有赖于进一步的临床使用情况最后确定。
       　参考文献：
       ［1］易毛，李筠，刘云，等.复方黄芪颗粒的薄层色谱鉴别研究［J］.中国新医药，2003，2(7):1920.
       ［2］李光喜.首乌补汁的薄层色谱鉴别［J］.广东药学院学报，2003，19(1)：1011.
       ［3］唐丽琴，刘圣，陈礼明，等.高效液相色谱法测定复方黄连颗粒中葛根素的含量［J］.中国药房，2003，14(7)：425427.
       ［4］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：附录ⅥB.
       ［5］阎巧娟，韩鲁佳，江正强，等.黄芪皂苷的提取分离方法［J］.中国农业大学学报，2000，5(6)：6165.
       (1.南方医科大学，广东 广州510515；2.广东化工制药职业技术学院，广东 广州            510500)
       作者简介：郭建生(1971)，男(汉族)，江西遂川人，现任南方医科大学主治中医师，硕士学位，主要从事中医药学工作.
       收稿日期：20050308