文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       随机扩增多态性DNA（RAPD）技术是近年来广泛应用的分子标记技术之一，以PCR反应为基础，其特点是快速简便、易操作、成本较低，DNA需要量少、无需放射性分析，也不会污染等。该文简述了RAPD技术的原理及优缺点以及其在药用植物遗传多样性分析、药材鉴别和DNA指纹图谱的构建、亲缘关系及系统学研究、药材的道地性等方面的应用，并展望了其发展前景。
       【关键词】  随机扩增多态性DNA 遗传多样性 药材鉴别 道地性
       分子标记（Molecular marker）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映，以其快速、准确、所提供的信息量大、不受环境影响等特点，已被广泛应用于遗传学评价、目的基因定位和遗传图谱的构建等领域。随机扩增多态性DNA（RAPD）技术是近年来广泛应用的分子标记技术之一，以PCR反应为基础，其特点是快速简便、易操作、成本较低、DNA需要量少、无需放射性分析也不会污染等［1］。
       1  RAPD技术的原理
       
       RAPD （ random amplified polymorphic DNA ）是 1990 年美国杜邦公司科学家 J. G. K. Williams 和加利福尼亚生物研究所 J. Welsh 领导的两个小组几乎同时发展起来的一项新的分子标记技术。Williams 称之为 RAPD，Welsh 称之为 AP-PCR（arbitrary primer PCR）。 其建立在 PCR 技术基础上，是以任意序列的寡核苷酸单链 ( 通常为10个碱基，AP-PCR 则为20～30个碱基) 为引物，对所研究的基因组 DNA 进行随机扩增。RAPD 所用的一系列引物的 DNA 序列各不相同，但对于任一引物，它同基因组 DNA 序列有特定的结合位点。这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合 PCR 扩增的反应条件，即在一定范围内模板 DNA 上有与引物互补的反相重复序列时，就可扩增出此范围的 DNA 片段。在不同物种基因组 DNA 中，这种反相重复序列的数目和间隔的长短不同，就可导致这些特定的结合位点分布发生相应的变化，而使 PCR 扩增产物增加、减少或发生分子量的变化。 通过对 PCR 产物的检测和比较，即可识别这些物种基因组 DNA 的多态片段。
       2  RAPD技术的优缺点
       2.1  RAPD技术的优点分子标记的种类很多，RAPD标记技术能够成为最广泛应用的分子标记技术之一，是因为与其它分子标记技术相比，有很多独特的优点［2］。
       
       ①不需DNA探针，设计引物也不需要知道序列信息；②用一个引物就可扩增出许多片段(一般一个引物可扩增6～12条片段，但对某些材料可能不能产生扩增产物)，总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法；③技术简单，RAPD分析不涉及Southern杂交、放射自显影或其它技术；④不象RFLP分析，RAPD分析只需少量DNA样品；⑤成本较低，因为随机引物可在公司买到，其价格不高；⑥无需专门设计 RAPD 扩增反应的引物，也无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，引物是随机合成或是任意选定的［3］。⑦每个RAPD 反应中，仅加单个引物，通过引物和模板 DNA 链随机配对实现扩增，扩增没有特异性。⑧较之常规 PCR，RAPD 反应易于程序化。利用一套随机引物，得到大量 DNA 分子标记，可以借助计算机进行系统分析。
       2.2  RAPD技术的缺点RAPD技术虽然有很多优点，但是也不可避免的存在一些缺点：①RAPD标记一般是显性遗传(极少数是共显性遗传的)，这样对扩增产物的记录就可记为“有/无”，但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子；②RAPD分析中存在的最大问题是重复性不太高，因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变；但是，如果把条件标准化，还是可以获得重复结果的；③由于存在共迁移问题，在不同个体中出现相同分子量的带后，并不能保证这些个体拥有同一条(同源)的片段；同时，在胶上看见的一条带也有可能包含了不同的扩增产物，因为所用的凝胶电泳类型(一般是琼脂糖凝胶电泳)只能分开不同大小的片段，而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。
       3  RAPD技术在药用植物研究中的应用
       
       目前，RAPD技术在药用植物研究中得到了广泛的应用。其主要用于药用植物遗传多样性分析，药材鉴别和DNA指纹图谱的构建，亲缘关系和系统学研究，药材的道地性等各个领域。此外，Kitanaka还用RAPD技术对人参和西洋参的杂交一代进行了鉴定。
       3.1  遗传多样性分析对于任何一个物种来说，其遗传多样性越丰富，对环境变化的适应能力就越强，就越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。所以，对遗传多样性的研究不仅可以揭示物种或居群的进化历史，也能为进一步分析其进化潜能和未来的命运提供重要的信息。此外，它还可以帮助我们正确了解不同分类群间的亲缘演化关系，为生物的分类和进化研究提供有益的资料，为分类系统的建立提供强有力的佐证。
       
       吴卫（博士学位论文，2002）应用RAPD标记对92份鱼腥草种质资源遗传多样性进行检测，结果发现鱼腥草种质资源在分子水平上确实存在较大遗传差异，RAPD标记可作为构建鱼腥草DNA指纹图谱的有效工具，鱼腥草药材道地性与环境因素有关，但更大程度上由其遗传因素决定。邹佳宁等［4］对贵州省境内药用植物天麻的野生和栽培15个样品的基因组DNA遗传多态性进行RAPD分析，表明野生与栽培天麻之间的遗传变异较大，说明地理分布和生长环境的差异是导致天麻形成丰富的遗传多态性的一个重要的原因。张建清等［5］从DAN分子水平上分析甘肃党参主要栽培区的9个栽培居群和4个自然居群的遗传多样性和遗传关系，进而探讨纹党参的来源，RAPD分析结果揭示了甘肃栽培的党参和素花党参在居群水平上具有丰富的遗传多样性。彭锐等［6］利用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术分析了15种石斛属药用植物，分析结果表明，RAPD方法能有效鉴别所试石斛属植物，其多态位点百分率为84.85％，表现出丰富的遗传多样性。Pan等［7］对广藿香的研究表明，应用RAPD随机引物对广藿香遗传多样性的分析及不同居群的鉴定是可行的。RAPD技术为广藿香遗传种质资源的鉴定和分类提供了新的途径。Rout GR［8］运用RAPD技术对心叶青牛胆进行研究，证明RAPD技术具有检测药用植物遗传变化的潜力。
       3.2  药材鉴别和指纹图谱的构建长期以来，局限于粗放经营的种植方式，药材存在种质不清、品种混杂和种质退化严重的现象，严重影响了我国药材的出口，现在我国的中药在国际市场上仅占4％的份额，这与我们中药大国的身份和地位严重不符，运用RAPD技术可以在分子水平上解决我国药材严重混杂的现状。
       
       王润玲等［9］采用RAPD技术进行了玉竹及其掺伪品热河黄精、黄精等药用植物的鉴别，证明RAPD技术可用作区分玉竹及其掺伪品的依据。胡挺松等［10］用RAPD技术对红景天属的大花红景天、长鞭红景天、狭叶红景天和高山红景天4种药用植物进行分子水平鉴定，证明了RAPD法能有效地鉴别红景天类药材，把大花红景天、长鞭红景天、狭叶红景天和高山红景天区分开。周晔等［11］采用原植物鉴定、性状鉴定、显微鉴定和RAPD手段，对中药黄精及主要掺伪品长梗黄精进行鉴别，表明RAPD技术为黄精与长梗黄精的区分提供了分子鉴别依据。黄芸等［12］用RAPD技术对射干类药材射干及混淆品鸢尾、野鸢尾、蝴蝶花、德国鸢尾等5种药用植物进行分子水平的鉴定，研究结果表明RAPD法能有效的鉴别射干类药材，把射干和鸢尾、野鸢尾、蝴蝶花、德国鸢尾等药用植物区分开。曾明等［13］采用RAPD技术对葛属6种植物进行分析，利用RAPD及PHYLIP软件包进行数据处理，结果发现，峨嵋葛与野葛的遗传距离小，应归为野葛、野葛与粉葛、山葛间的遗传距离大，粉葛、山葛应独立成种。指纹图谱可用于葛属植物间的鉴别。沙明等［14］采用RAPD技术对地榆属的4个品种及其混淆品进行分析， RAPD可提供清晰RAPD指纹谱，表明RAPD技术可以做为4种地榆品种及其混淆品的质量评价方法。Guo WL等［15］对车前的研究表明，RAPD技术能够很好的鉴别不同地域车前之间的差别。在生药鉴定方面，该方法在人参及其伪品、甘草、黄连、冬虫夏草及其伪品、贝母等药材的鉴定中都有应用。
       3.3  亲缘关系和系统学研究植物在长期的演化过程中，类群之间存在或远或近的亲缘关系，亲缘相近的种类其遗传上的联系也必然相近，运用RAPD技术分析药用植物的亲缘关系，可以进一步了解药用植物的遗传关系，为优良品种的选育和药材的分类和鉴定打下坚实的基础。
       
       李娟等［16］用RAPD分子标记技术鉴别8种卷柏属药用植物并进行亲缘关系分析，并建立了8种卷柏属植物类群亲缘关系的树系结构图，该方法显示了8种卷柏属植物之间明显的种间差异，能为这些植物种以及种下的分类鉴定提供遗传学依据。丁鸽等［17］采用RAPD分子标记技术，对铁皮石斛8个野生居群的遗传多样性、亲缘关系以及分子鉴别等进行研究，表明铁皮石斛居群间遗传差异明显，具有较丰富的遗传多样性，RAPD可以作为铁皮石斛野生居群遗传多样性、居群亲缘关系和分子鉴别研究的有效手段。虞泓等［18］对云南常见的3种6个居群59个红景天样品进行了遗传关系研究，结果表明RAPD分子标记可很好地用于红景天物种的分子鉴定和遗传背景研究。傅大煦等［19］从DNA分子水平上分析新疆药用桑树资源9个栽培群体的遗传关系，发现RAPD分析结果与新疆药用桑树资源植物的遗传关系的传统划分是基本一致的。Warude等［20］用RAPD技术对余甘子的遗传特性进行研究，证明RAPD技术可以很好的鉴别余甘子的亲缘关系。
       3.4  药材的道地性古人云：“诸药所生，皆有其界”，可见生态地理因素对中药材质量具有重要的影响。“地道药材”是同种异地，是生物学上的“居群”，是一个具有共同基因库的由交配和亲缘关系联系起来的同一物种的个体群，它的形成是由基因型与环境饰变共同作用的结果。因此，研究中药资源的生态地理不仅将揭示我国中药资源的分布规律，为中药种植区划研究打下基础，而且从生态地理的高度研究地道药材形成的环境原因，并与遗传基因的研究一起为解释药材地道性提供理论基础，从而打造出我国的“地道药材”商品基地，使中药资源中得到持续利用。
       
       顾华等［21］运用随机扩增多态DNA（RAPD）方法研究了来自山西黎城、长治、平顺、壶关、吞留及安泽6个地区11个连翘地方栽培品系的亲缘关系，结果显示运用RAPD分析手段进行药材道地性研究具有可行性。雷高鹏等［22］对来自四川、湖北、浙江、上海的麦冬的13个居群和两个沿阶草种的RAPD分析，也证明RAPD是一个能有效区分麦冬与其他同属物种以及麦冬道地性分析的方法。李颖等［23］利用RAPD技术、琼脂糖电泳等技术研究了广藿香的道地性，显示了不同产地广藿香基因组的多态性，为广藿香的道地鉴别和引种栽培的质量控制提供一种新方法。
       4  展望
       
       随着生物技术手段的发展，分子标记技术必然会得到广泛的应用，RAPD技术出现虽然短短几年的时间，但在其应用过程中显示了广泛的前景，特别是在药用植物方面也得到了很好的发展。笔者认为随着分子生物学技术的不断发展和药用植物分子遗传特征研究的不断深入，RAPD技术将在药用植物研究领域中得到更加广泛的应用。
       【参考文献】
         　　［1］ Leila Medraoui, Mohammed Ater, Ouafae Benlhabib, et al. Evaluation of genetic variability of sorghum (Sorghum bicolor L. Moench)in northwestern Morocco by ISSR and RAPD markers［J］.C.R.Biologies., 2007(330):789.
       
       ［2］ 丁群英，张 显. 分子标记技术在西瓜甜瓜上的应用［J］.果树学报, 2005,22(3)：271.
       
       ［3］ 王和勇, 罗 恒, 孙 敏. RAPD在中药材鉴别中的稳定性和可靠性［J］.中药材, 2004, 27(1):63.
       
       ［4］ 邹佳宁, 宋聚先, 常楚瑞,等. 贵州天麻种质资源的RAPD分析［J］.中药材, 2006,29(9): 881.
       
       ［5］ 张建清, 苏 雪, 吴 琼, 等. 药用植物党参的 RAPD 分析［J］.中药材, 2006, 29(5):417.
       
       ［6］ 彭 锐，李泉森，李隆云. 石斛的分子生物学鉴定—基于RAPD分析［J］.西南农业大学学报(自然科学版)，2004,26(4):437.
       
       ［7］ 潘超美，李 薇，贺 红，等.不同栽培居群广藿香的种内遗传多样性研究［J］.中国中药杂志，2006,31(9)：723.
       
       ［8］ Rout GR. Identification of Tinospora cordifolia(Wild.)Miers ex Hook or Thomas using RAPD markers［J］.Z Naturforsch, 2006,61(1～2):118.
       
       ［9］ 王润玲，唐 铖，周 晔,等.玉竹及其掺伪品的 RAPD鉴定［J］.中草药，2006，37(11)：1727.
       
       ［10］ 胡挺松, 陆一鸣, 马兰青,等. 红景天属4种植物RAPD分析与分类鉴定［J］.中草药. 2004, 35(11): 1286.
       
       ［11］ 周 晔，王润玲，唐 铖，等. RAPD标记法鉴定中药黄精及长梗黄精的研究［J］.时珍国医国药, 2007, 18(9)：2149.
       
       ［12］ 黄 芸，秦民坚，杨 光，等. RAPD 法鉴定射干类中药［J］.中草药，2002，33(10)：935.
       
       ［13］ 曾 明, 严继舟, 张汉明, 等. RAPD技术在葛属药用植物分类和鉴定中的应用［J］.中草药,2001,31(8):620.
       
       ［14］ 沙 明，张东方，孟宪生，等. DNA指纹谱与HPLC指纹谱对中药地榆质量评价研究［J］.中国药学杂志, 2002, 37(11):815.
       
       ［15］ Guo WL, Gong L, Ding ZF, et al. Genomic instability in phenotypically normal regenerants of medicinal plant Codonopsis lancelolata Benth. Et Hook.f. as revealed by ISSR and RAPD markers［J］.Plant cell Rep. 2006, 25(9): 896.
       
       ［16］ 李 娟，万定荣，陈科力. 8种卷柏属药用植物的RAPD分析［J］.中药材，2007，30(4): 403.
       
       ［17］ 丁 鸽，丁小余，沈 洁，等. 铁皮石斛野生居群遗传多样性的RAPD分析与鉴别［J］.药学学报, 2005,40(11): 1028.
       
       ［18］ 虞 泓，朱荣勋，李永谊, 等. 云南常见药用红景天的RAPD 分析［J］.中草药，2005，36(1)：96.
       
       ［19］ 傅大煦, 张 辉, 陈 纹. 新疆药用桑树9个栽培群体的RAPD 分析［J］.中草药, 2004,35(9):1053.
       
       ［20］ Warude,Chavan,Joshi, et al. Development and application of RAPD-SCAR marker for identification of Phyllanthus emblica LINN［J］.Biol.Pharm.Bull.,2006,29(11): 2313.
       
       ［21］ 顾 华, 盖 玲, 周铜水, 等. 中药材连翘道地性的分子生物学探讨［J］.复旦学报(自然科学版), 2002，6:664.
       
       ［22］ Lei GP, Qiao DR, Xiong Y, et al. Identification of Ophiopogon japonicus ker-gawl as geo-herbal based on RAPD analysis. Journal of Sichuan University (Natural Science Edition) ［J］.2006，43(6):1373.
       
       ［23］ 李 颖, 李劲平. 广藿香道地行的RAPD研究［J］.现代医药卫生，2006，22(13)：2027.