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       【摘要】 
       目的研究白花蛇舌草对人肺巨细胞癌细胞株PG细胞端粒酶活性的影响，以探讨其抗肿瘤的作用机制。方法用不同浓度的白花蛇舌草含药血清分别处理人肺巨细胞癌细胞株PG细胞，采用流式细胞仪法观察其对PG细胞端粒酶活性的影响。结果经白花蛇舌草含药血清作用的PG细胞端粒酶活性明显下降。结论下调肿瘤细胞的端粒酶活性，可能是白花蛇舌草抗肿瘤的重要机制之一。
       【关键词】  白花蛇舌草 肺癌细胞PG 端粒酶
       中药白花蛇舌草(Herba Hedyotis Diffusae)为茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.的干燥全草。白花蛇舌草在临床上广泛应用于各种癌症的治疗，尤多用于治疗消化系统肿瘤如食道癌、胃癌、肝癌、直肠癌以及子宫癌、淋巴癌、鼻咽癌等。端粒及端粒酶是当今国际生物医学界的研究热点，人们普遍认为，端粒酶的激活在恶性肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用,可能是细胞永生化和恶性肿瘤发生的关键环节［1～3］。本实验研究试图从端粒酶活性变化的角度来探讨白花蛇舌草的抗肿瘤作用机制，为白花蛇舌草抗肿瘤新药的开发和研制提供依据。
       1    器材
       
       白花蛇舌草（Herba Hedyotis Diffusae）购自济南市建联中药店，并由山东中医药大学药学院生药系石俊英教授鉴定。
       
       人肺巨细胞癌细胞株PG细胞，由山东省医学科学院基础所提供。
       
       Wistar大鼠，雄性，体重200～240 g，由山东中医药大学实验动物中心提供。
       
       流式细胞仪(FACScan型,美国BD公司)，倒置相差显微镜（美国AO），CO2培养箱，超低温冰箱，超净工作台(BCM1000型,苏州净化设备有限公司)。
       
       一抗鼠抗人单抗，Calbiochem公司；端粒酶以及二抗藻红蛋白荧光素（PE）标记的羊抗鼠IgG1，美国Pharmingen公司；RPMI1640培养基，Gibco公司；小牛血清，杭州四季青生物材料研究所；顺铂(DDP) 齐鲁制药有限公司；胰蛋白酶，GIBCO分装，伯安生命技术有限公司。
       2  方法与结果
       2.1  白花蛇舌草水提取物的制备称取白花蛇舌草200 g，加适量水浸泡1～2 h，水煎煮提取两次，合并提取液，浓缩成一定浓度（剂量为50 g生药/kg），即得白花蛇舌草水提取物。
       2.2  含药血清的制备取Wistar大鼠20只，随机分成正常血清组10只，含药血清组10只。含药血清组每日分别予白花蛇舌草4 ml/次，2次/d灌胃，正常血清组每天给予等量生理盐水灌胃，连续给药3 d，末次给药后1 h，乙醚麻醉，腹主动脉无菌采血，置无菌离心管离心10 min（1 500 r/min），无菌分离血清，经56℃，30 min 灭活，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装入小瓶，置-20℃冰箱保存备用。
       2.3  流式细胞仪检测取对数生长期的PG细胞，经0.25%胰酶消化，计数，以2×105 ml的量接种于培养瓶中，37℃5% CO2含10%小牛血清的1640培养基中培养24 h，至细胞生长旺盛贴壁后,去掉原培养液，分别加入不同浓度的含药血清及DDP，于培养箱中继续培养24 h，0.25%胰酶消化，离心，用PBS液洗涤2次，制成细胞悬液，取500 μl，加一抗工作液和阴性对照一抗IgG120 μl 20 min，再加二抗工作液20 μl，避光反应30 min，上机检测。结果见表1。
       
       共分6组：1组10%正常血清组；2组5%白花蛇舌草含药血清组；3组10%白花蛇舌草含药血清组；4组15%白花蛇舌草含药血清组；5组1 μg/ml DDP+10%正常血清组；6组1 μg/ml DDP+10%含药血清组。
       表1  不同浓度白花蛇舌草含药血清对PG细胞端粒酶表达的影响（略）
       与正常血清组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与DDP组比较，*P<0.05，**P<0.01
       3  讨论
       
       端粒酶(telomrase)是一种核糖蛋白酶，能以自身RNA为模板,以染色体3"末端DNA为引物延伸端粒DNA。端粒酶在约90%以上的恶性肿瘤中呈阳性，其活性的表达被认为是恶性肿瘤发生发展中的一个关键事件，是恶性肿瘤细胞得以无限增殖的必需条件,而在正常组织细胞端粒酶活性较低，王曦［4］综述了14份国外研究资料，其恶性肿瘤端粒阳性率达88%，而周围正常组织和非癌组织端粒酶阳性率达12.1%和4.2%。Mori等也认为在癌症化学预防端粒酶是目前已知的最为广谱的肿瘤分子标记物，并且有可能成为肿瘤治疗新的靶点。
       
       由于端粒酶的激活是细胞走向不死性的关键，而不死性则是肿瘤恶性增殖的必要步骤［5］，根据这一理论可以设想，抑制端粒酶活性将阻止肿瘤无限增殖的能力。本实验采用流式细胞仪检测不同浓度白花蛇舌草含药血清对PG细胞端粒酶表达的影响，并与DDP进行参照，结果表明， 正常血清组端粒酶表达率最高, 而DDP组和白花蛇舌草含药血清组均有不同程度的下降，而且端粒酶下调的程度与含药血清的浓度呈正相关，随着含药血清浓度的增高，细胞的端粒酶活性也逐渐下降；白花蛇舌草含药血清与DDP合用组，与单用DDP组比较，有非常显著性差异（P<0.01），说明白花蛇舌草可以明显增强DDP的下调肿瘤细胞端粒酶活性的作用。但白花蛇舌草是通过何种机制使PG细胞端粒酶活性下降，尚有待进一步的研究。
       【参考文献】
         　［1］ Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer［J］. Science,1994,266:2011.
       
       ［2］ Chadeneau C, Hay K, Hirte H W, et al. Telomerase activity associated with acquisition of malignancy in human colorectal cancer［J］.Cancer Res.1995,55:2533.
       
       ［3］ Meyerson M, Counter CM, Eaton EN, et al. hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up regulated in tumor cells and during immortalization.［J］. Cell,1997,90:785.
       
       ［4］ 王 曦.端粒酶及其在肿瘤诊治方面的研究［J］.国外医学·肿瘤学分册，1998,4(2):80.
       
       ［5］ Greider CW. Telomerase activity, cell proliferation, and cancer［J］.Proc Natl Acad Sci USA 1998,95:90.