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       【摘要】 
       目的研究白刺总黄酮对血管内皮细胞损伤的保护作用及机制。方法用过氧化氢（H2O2）诱导血管内皮细胞损伤,用酶标仪检测细胞内一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）以评价氧化的程度。结果不同浓度的白刺总黄酮可促进受损的内皮细胞修复，同时提高SOD、NOS、GSH-Px活力和NO水平。结论白刺总黄酮具有保护血管内皮细胞损伤的作用，其机制可能与其抗氧化作用有关。
       【关键词】  白刺总黄酮 内皮细胞 过氧化氢 抗氧化
       白刺为我国的特有种，在新疆干旱地区分布广泛，其果实中含有丰富的营养成分和活性物质，可入药，具有调经活血，消食健脾等功效。课题组对白刺总黄酮进行分离发现含有槲皮素、山萘酚、异鼠李素等黄酮单体化合物，它们都具有一定的抗氧化能力［1～3］。总黄酮与其单体化合物进行对比抗氧化能力强弱尚未见报道。内皮细胞损伤直接或间接的反应氧化程度，同时内皮细胞损伤是动脉硬化发生的始动环节［4］。因此本实验利用体外细胞培养方法，用H2O2诱导HUVEC损伤，槲皮素做阳性对照，研究白刺总黄酮对HUVEC损伤的保护作用及可能机制。
       1  材料
       
       0.1%Ⅰ型胶原酶(武汉博士德生物工程有限公司)；PBS（Phosphate Buffered Saline）;缓冲液(JMF-0006天津津脉) ;胎牛血清(CHARACTERIZED公司) ;SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20080626);GSH-Px试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20080626); NO试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20080626 );  NOS 试剂盒(南京建成生物工程研究所,批号20080626 ); TDL-5000低温冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂); PufferHubbard超低温冰箱(美国HARRIS公司);XW -80A旋涡混合器(上海精科实验有限公司);电热恒温水浴锅(北京泰克仪器有限公司);超净台(ZHJH-1112B苏州公司) ；CO2 孵箱(Thermo Formo公司) ； 双向磁力搅拌器(79-2 江苏金坛市医疗仪器厂)；电子分析天平(AE-200 上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；倒置相差显微镜(BDS200-PH奥特光学 OPTEC)； 酶标仪(SN-3001 Thermo Formo公司)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240 上海齐欣科学仪器有限公司)；立式电热压力蒸气灭菌器(LDZX-30FBS 上海申安医疗器械厂)。
       2  方法
       2.1  白刺总黄酮的制备取白刺果，75%乙醇进行连续回流提取4次，每次加75%乙醇7倍量回流2 h，分别过滤浓缩至浓膏无醇味，用2.5％碳酸钠(pH8)溶解浓膏,过滤；过滤液用50%盐酸调至pH为5,过滤得沉淀用水洗至中性，烘干。利用聚酰胺柱层析分离得白刺总黄酮。对其用Sephadex LH-20进行分离纯化得槲皮素［5］。
       2.2  HUVEC的培养及分组 HUVEC的原代培养:按文献［6］报道以及在实验中的摸索对方法行进了改进。2007-10～2008-04,在我院妇产科产婴室收集健康胎儿脐带20～40 cm,用0.1%胶原蛋白酶得到人胎儿脐静脉内皮细胞。培养于ECM培养液中,置于37℃下5%CO2培养箱中。进行培养传到第3代用于试验。实验分正常对照组、阳性对照组（加75μmol/L H2O2＋槲皮素80 μmol/L）、模型组(仅加75μmol/L H2O2)和白刺总黄酮低、中、高3个剂量组(均加75 μmol/L H2O2及分别加20 μmol/L白刺总黄酮、40 μmol/L白刺总黄酮、80μmol/L白刺总黄酮),每组6例。
       
       将2×104个/孔HUVEC接种6孔板,在上述条件下孵育24 h，分别加入上述浓度的槲皮素和白刺总黄酮，各组细胞孵育24  h，然后除正常对照组外加入75μmol/L H2O2诱导损伤，继续培养4 h后终止培养，进行有关指标的测定。
       2.3  检测方法NO，NOS，SOD，GSH-Px的具体测定方法参照试剂盒说明书进行。
       3  结果
       3.1  白刺总黄酮对受损内皮细胞NO含量和总型NOS、结构型NOS活力的影响NO不仅能调节血管舒张，还是一种重要的抗炎分子,NO减少可以加速内皮细胞损伤［7］。从测定数据显示，模型组与正常对照组比较有显著性差异（P<0.01），表明H2O2诱导内皮细胞受损模型复制成功；从各组的NO水平可看出模型组比阳性对照组有明显降低（P<0.05），不同剂量的总黄酮组随着浓度的升高NO的浓度也升高，与相同剂量的阳性对照组比虽没有统计学意义但数值相对较高。
       
       NOS催化L-Arg和分子氧反应生成NO，NOS即为总型NOS(TNOS)主要有两种类型：即结构型（cNOS)和诱导型（iNOS)，cNOS主要分布在神经元和内皮细胞内。从各组的NOS活力水平可看出模型组比阳性对照组明显降低（P<0.01），不同剂量的总黄酮组随着浓度的升高cNOS活力也升高，与相同剂量的阳性对照组比活力相对较高，高剂量黄酮组cNOS活力比正常对照组虽也没有统计学意义但活力也相对较高。见表1。
       表1  白刺总黄酮对受损内皮细胞NO含量和TNOS、cNOS活力的影响（略）
       与正常对照组比较，***P<0.001,**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01； 与阳性对照组比较，为#P<0.5 ；n=6
       3.2  白刺总黄酮对受损内皮细胞SOD、GSH-Px活力的影响超氧化物歧化酶（SOD）对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用。从各组的SOD活力水平可看出模型组比阳性对照组有极明显降低（P<0.001），表明H2O2诱导内皮细胞受损对SOD活力影响较大，不同剂量的总黄酮组随着浓度的升高SOD活力也升高，与相同剂量的阳性对照组比活力相对较高。黄酮高、中剂量组与模型组对比明显使SOD活力增高。
       
       GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶。它特异的催化还原型谷胱甘肽（GSH）对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。从各组的GSH-Px活力水平可看出模型组比阳性对照组有极明显降低（P<0.001），这与文献报道一致［8］。不同剂量的总黄酮组随着浓度的升高GSH-Px活力也升高，但增加的幅度相对较小；黄酮高、中剂量组与模型组对比明显使GSH-Px活力增高。见表2。
       表2  白刺总黄酮对受损内皮细胞SOD、GSH-PX活力的影响（略）
       与正常对照组比较，***P<0.001,**P<0.01;与模型组比较：△△△P<0.001；与阳性对照组比较，##P<0.1,#P<0.5；n=6
       4  讨论
        
       血管内皮细胞内可以合成和释放重要的血管活性物质，对各种不同的病理生理刺激可产生功能变化，H2O2是活性氧，可促进自由基生成 ［9～10］。生物体内H2O2如不及时消除可透过细胞膜，膜外与Fe2+或Cu2+在生成羟自由基（·OH），从而加速氧化物质的生成，而这些又是动脉粥样硬化的始动因素，它对糖尿病、冠心病、高血压病等疾病的发生和发展起着重要的影响［11～13］。
         
       实验证明，白刺总黄酮高剂量组与同剂量的槲皮素阳性对照组行进比较，NO含量、TNOS活力、cNOS活力以及SOD活力都相对较高，较明显的修复H2O2诱导的内皮细胞的损伤。GSH-Px活力随着白刺总黄酮的剂量增加，活力随之提高。由上述结果，我们可以推测白刺总黄酮可能含的其它单体化合物由于抗氧化作用较强致使整体的抗氧化能力提高，通过降低自由基的生成，提高内皮细胞各种酶的活性来修复受损的内皮细胞。
       【参考文献】
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