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       【摘要】 
       目的建立甘肃青兰属植物中多糖的含量测定方法。方法利用苯酚－硫酸法显色，在490 nm波长处用紫外分光光度法测定多糖含量。结果回归方程：Y=0.014 00X+0.000 17 ，r= 0.999 6。测得异叶青兰、香青兰、岷山毛建草和唐古特青兰多糖含量分别为13.38%,10.42%,5.795%,15.07%；平均回收率及其RSD分别为95.03%，3.063% (n= 5)；96.42% ，2.830% (n= 5)；95.85%，2.470% (n= 5)；101.1%，2.044% (n= 5)。结论所用方法快速、准确、灵敏，可作为青兰属植物中多糖的含量测定方法。
       【关键词】  异叶青兰 香青兰 岷山毛建草 唐古特青兰 多糖 苯酚－硫酸法
       异叶青兰Dracocephalum heterophyllum Benth.，香青兰D. moldavicum L.，岷山毛建草D. purdomii W.W.Smith.和唐古特青兰D. tanguticum Maxim.均为唇形科Labiatae青兰属（Dracocephalum）多年生草本植物。青兰属是唇形科中分布较广泛的一个属,全球约有60种，主要分布于亚洲温带，多在高山干旱地区，少数延至中欧及北欧，1种分布于北美，我国约32种7变种，分布于东北，华北，西北及西南［1］。甘肃青兰属植物有5种，其中4种可作药用［1,2］。多年来该属植物一直被广泛应用，有清热、止咳、凉血的功效，主要用于治疗胃病、肝病、头痛等。多糖有抗肿瘤、抗流感、清除氧自由基、增加机体免疫力、防衰老及抗辐射等作用。香青兰多糖对活性氧自由基具有良好的清除能力［3］。本文对甘肃青兰属4种植物中的多糖含量进行了测定，为开发利用该属植物资源及进一步研究提供依据。
       1     仪器与材料
       1.1   仪器 UV－2450紫外分光光度计(日本岛津) , FA2004B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。
       1.2   材料 样品均采自甘肃省, 经兰州大学药学院生药研究所马志刚教授鉴定分别为唇形科青兰属植物异叶青兰Dracocephalum heterophyllum Benth.，香青兰D. moldavicum L.，岷山毛建草D. purdomii W.W.Smith.，唐古特青兰D. tanguticum Maxim.，葡萄糖（中国生物制品检定所，批号20050615），其他试剂均为分析纯。
       2     方法与结果
       2.1    溶液的配制
       2.1.1    对照品溶液的配制 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.100 3 g，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（每毫升中含无水葡萄糖1.003 mg）。
       2.1.2    5%苯酚液的配制 取苯酚100 g，加入0.1 g铝片和0.05 g碳酸氢钠，加热蒸馏，收集182 ℃馏分。精密称取该馏分5.007 g，置100 ml棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。
       2.1.3    供试品溶液的制备 分别称取干燥实验材料粉末5 g，加蒸馏水50 ml， 回流提取1 h。过滤,滤渣重复上述操作两次，合并提取液，浓缩至适量，加入乙醇使乙醇含量为80%放置12 h，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤，干燥，精密称取干燥的粗多糖提取物各30 mg置25 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤。唐古特青兰取续滤液1.0 ml，其余各取续滤液2.0 ml分别置25 ml容量瓶中，加水定容，即得。
       2.2  检测波长的选择 取葡萄糖对照品溶液及4种供试品溶液，在400～800 nm波长扫描。结果见图1， 显色后葡萄糖溶液及供试品溶液在490 nm波长处有最大吸收。说明在490 nm波长处供试品溶液中其他成分对多糖的显色与吸收无干扰，故选定490 nm为测定波长。
       图1  葡萄糖溶剂及供试品溶液光谱图（略）
       2.3  标准曲线制备 精密量取葡萄糖对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 ml于50 ml 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取2.00 ml分置7支具塞试管中，另精密吸取2.0 ml水为空白。分别加入5%苯酚溶液1 ml，摇匀，加入5 ml浓硫酸(加入浓硫酸时，应将移液管口悬于试管口, 使浓硫酸垂直冲入液面)振摇5 min，置沸水浴加热15 min，冷水浴冷却30 min，在490 nm 处测吸光度(A )。绘制标准曲线，得线性方程Y =0.01400X+0.00017，r= 0.9996。结果表明，葡萄糖溶液在8.000～56.00 μg/ml范围内与吸光度值呈良好的线性关系。
       2.4  精密度实验分别精密吸取4种供试品溶液2.0 ml于具塞试管中，依“2.3”项下方法显色，测定A值，求得其RSD分别为1.129%,0.7079%，1.140%，1.632% (n= 5)。
       2.5  显色稳定性 将4种供试品溶液完成显色后，2 h内连续测定，得其A值比较稳定。
       2.6  重复性实验取4种供试品，分别精密称取6份，制备供试品溶液并测定多糖含量，结果异叶青兰、香青兰、岷山毛建草、唐古特青兰中多糖的含量分别为13.92%，10.52%，5.819%， 15.05%；RSD分别为1.763%，1.682%，1.614%，2.429% (n= 6)。
       2.7  回收率实验 取已知含量的4种供试品溶液，分别加入一定量的葡萄糖对照品溶液，混匀后取2 ml于具塞试管中，依“2.3”项下方法显色，测定吸光度，计算回收率。结果异叶青兰、香青兰、岷山毛建草、唐古特青兰的平均回收率及其RSD分别为95.03%，3.063% (n= 5)；96.42% ，2.830% (n= 5)；95.85%，2.470% (n= 5)；101.1%，2.044% (n= 5)。
       2.8    样品的测定 按上述“2.1.3”和“2.3”项下方法操作，测定了12批样品中的多糖。结果见表1。
       表1  多糖含量测定结果（略）
       3  讨论
       3.1  本实验测定方法的原理利用多糖易溶于热水不溶于80 %乙醇的性质，先用热水提取多糖，再用80 %乙醇沉淀得到多糖，除去单糖、低聚糖及其他干扰性成分。提取的多糖制成水溶液，多糖在H2SO4的作用下，先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚作用生成有色化合物，用比色法测定含量。
       3.2  浓硫酸加入方式的选择实验发现，加入浓硫酸的操作方法是影响显色结果的主要因素。常规试剂加入方法引起显色结果不平行。采取“移液管悬空，垂直加入浓硫酸，立即摇匀”的方式和“缓慢沿壁加入浓硫酸，分层，静置一定时间后摇匀”的加入方式，都能得到稳定的显色结果。但是不同操作方法显色结果不同。异叶青兰、香青兰、岷山毛建草、唐古特青兰样品与葡萄糖对照品都在“垂直加入浓硫酸、立即摇匀”的操作条件下显色反应最充分，故选择该操作步骤为实验条件。
       
       异叶青兰、香青兰、岷山毛建草、唐古特青兰提取物是组成较复杂的粗多糖产品，本方法以葡萄糖做对照，检测结果以葡萄糖计，得到稳定的检测结果。
       【参考文献】
         　　［1］ 科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志,65卷2分册［M］.北京：科学出版社,1977:361.
       
       ［2］ 赵汝能,张承忠，李文惠,等.甘肃中草药资源志(上，下册)［M］.兰州:甘肃科学技术出版社,2004:635,775.
       
       ［3］ 郭春梅,武荣兰,封 顺,等.香青兰多糖的提取、测定及其对活性氧自由基的清除作用［J］.生物活性物质的分离与提纯,2005,31(3):129.