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       【摘要】 
       目的探讨莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞株体外生长的影响。方法以不同的药物浓度作用人卵巢癌SKOV3细胞株后，采用MTT法检测对其抑制增殖作用，并通过倒置显微镜观察细胞形态学变化。结果莪术油注射液可明显抑制SKOV3细胞的生长，其抑制率与药物浓度、作用时间呈量-效、时-效关系；倒置显微镜观察到细胞密度明显减少，胞体变长，细胞内颗粒感增强，细胞界限模糊，胞浆减少, 细胞脱落呈悬浮状，存活细胞减少，细胞核出现裂解，可见细胞碎片，随着莪术油作用浓度的增加上述现象更加明显。结论莪术油注射液对人卵巢癌SKOV3细胞株具有明显抑制作用。
       【关键词】  莪术油注射液 人卵巢癌SKOV3细胞 抑制增殖
       卵巢癌是一类妇科恶性肿瘤,其在女性生殖器官恶性肿瘤中的发生率占第3位,但病死率却居第1位［1］。传统治疗手段如手术治疗及化疗、放疗等的不断进步使得患者的5年生存率较以往有了明显改善,但普遍报道仍低于40%。近年来，中草药用于治疗肿瘤取得可喜的进展，已引起人们的极大兴趣。莪术是活血化瘀、消癥散结之中药，其提取物莪术油具在抗肿瘤、调节免疫反应等方面成效显著［2］。本研究采用MTT法观察莪术油注射液对体外培养人卵巢癌SKOV3细胞株增殖的抑制作用，并对细胞形态学变化进行初步观察。
       1  材料与仪器
       
       细胞株：人卵巢癌SKOV3细胞购自中国医学科学院肿瘤研究所,由广西肿瘤防治研究所临床中心实验室传代保存。细胞用含有10%灭活小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液于37℃、5%CO2条件下培养。MR-300酶标仪为美国产,倒置显微镜为日本产。MTT(噻唑蓝)购自Sigma公司,RPMI1640和小牛血清为Gibco公司产品，其余均为国产分析纯试剂。莪术油注射液购自黑龙江瑞格制药有限公司（生产批号：051101,国药准字：H20023314）。
       2  方法
       2.1  噻唑蓝(MTT)法确定莪术油注射液对卵巢癌SKOV3细胞的存活抑制作用　取对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞,浓度为5×103个/ml，加入到96孔板，每孔加含细胞的培养液180 μl,置37℃,5% CO2培养箱孵育24 h后, 以依次加入终浓度为15.625，31.25，62.5，125，250 μg/ml莪术油注射液,同时以1640培养液作为空白对照组, 每孔的终体积均为200 μl，分别培养12，24，36，48 h后加入20 μl MTT(2 g·L-1),37℃,5% CO2培养箱孵育4 h后,弃上清液,每孔加入DMSO 200 μl,于492 nm波长处测定吸光度OD值，每个浓度平行测定3孔。按下列公式求出生长抑制率(IR)，通过由IR对浓度作图,求出半数抑制浓度IC50。实验重复3次取平均值。
       
       生长抑制率IR（%）= （1-实验组平均A值/空白对照平均A值）×100%
       2.2  细胞形态学观察　倒置显微镜观察：细胞爬片后,分别加入31.25，62.5，125μg/ml浓度的莪术油注射液作用48 h后，倒置显微镜观察，摄片。
       2.3  统计学处理所有数据用SPSS 11.0软件进行单因素方差分析分析，计量资料结果以±s表示，当P＜0.05认为差异有显著性意义。
       3  结果
       3.1  MTT 法检测结果MTT法检测不同浓度、不同时间莪术油注射液对SKOV3细胞抑制效果，见表1。
       
       结果表明，莪术油注射液对SKOV3细胞体外生长具有明显的抑制作用，其抑制作用随时间、浓度的增加而不断加强，呈现一定的-时-效、量-效关系，其中各浓度药物作用48 h后的抑制效果最好,计算出IC50=55.16 μg/ml。a= -0.339 0，b=0.235 6，r=0.927 1。
       3.2  倒置显微镜结果（细胞形态学变化）细胞培养48 h后观察，空白对照组SKOV3细胞生长旺盛，分裂相较多，细胞透明，细胞间连接紧密，密度较大呈复层性生长，部分重叠成簇状，形态多样，多角形或短梭形,胞核圆形或椭圆形,多突起，具有较好的折光性，胞浆丰富透亮,部分细胞内可见分泌颗粒，细胞为梭形或短梭形，细胞内颗粒较少，细胞核隐约可见，培养液中极少见悬浮的死亡细胞以及细胞碎片（见图1～2）。选择31.25，62.5，125 μg/ml浓度的莪术油作用细胞48 h后观察, 大体可见细胞密度明显减少，胞体变长,细胞内颗粒感增强，细胞界限模糊,细胞间隙逐渐增宽，细胞质减少,胞浆减少,细胞脱落呈悬浮状,存活细胞减少，细胞核碎裂，可见细胞碎片，随着莪术油作用浓度的增加，上述现象更加明显（具体见图3～8）。
       表1  莪术油注射液对SKOV3细胞增殖的抑制率（略）
       不同浓度之间比较的方差分析结果为F=309.901，组间均为P＜0.01；不同时间各组之间的方差分析结果为F=103.571，组间均为P＜0.01
       图1  人卵巢癌SKOV3细胞(100×,细胞镶嵌排列,呈栅栏状或成腺趋势生长)  （略） 
       图2  人卵巢癌SKOV3细胞(200×，显示瘤细胞形态) （略）
             
       图3  浓度31.25μg/ ml莪术油作用后卵巢癌SKOV3细胞显微镜观察图 (100×， 部分细胞核开始变形，颗粒感增强)  （略）    
       图4  浓度31.25μg/ ml 莪术油作用后卵巢癌SKOV3细胞显微镜观察图 (200×， 部分细胞体积增大，胞浆减少，培养液中出现死亡细胞)（略）
        
       图5  浓度62.5 μg/ ml 莪术油作用后卵巢癌SKOV3细胞显微镜观察图(100×，细胞损伤明显加重，细胞核变形明显)   （略）    
       图6  浓度62.5 μg/ ml 莪术油作用后卵巢癌SKOV3细胞显微镜观察图(200×，多数细胞体积增大，胞浆明显减少，培养液中死亡细胞增多)（略）            
       图7  浓度125 μg/ ml 莪术油作用后卵巢癌SKOV3细胞显微镜观察图(100×，核浆比例增大,细胞排列极性消失，颗粒感明显) （略）    
       
       图8  浓度125 μg/ ml 莪术油作用后卵巢癌SKOV3细胞显微镜观察图(200×，细胞损伤非常明显，细胞质颗粒脱落，胞浆溶解，培养液中大量死亡细胞和细胞碎片)  （略）  
       
       4  讨论
       
       莪术油作为一种具有良好应用前景的抗癌药物, 其方便、快捷、经济，日益引起人们的重视,成为研究的热点。本实验以莪术油注射液5种浓度,分别作用于卵巢癌SKOV3细胞12，24，36，48 h后,发现随药物浓度增加、作用时间延长,抑制率也增加。实验表明，药物作用48 h效果最明显,利用中效方程式计算出48 h的IC50值为55.16 μg/ml；小剂量莪术油(15.625 μg/ ml) 对SKOV3细胞的抑制作用并不明显。用浓度为31.25，62.5，125，250 μg/ml莪术油作用SKOV3细胞48 h后，其抑制率有明显的量-效关系；250 μg/ml的莪术油抑制率高达86.7%，但是在倒置显微镜下观察可见满视野的细胞碎片，绝大多数细胞坏死，几乎找不到贴壁细胞。因此，选择浓度为31.25，62.5，125 μg/ml的莪术油作用SKOV3细胞48 h后，主要从细胞体积、细胞质感、细胞浆、细胞质等方面，通过倒置显微镜进行形态学观察：与对照组比较，31.25 μg/ ml浓度莪术油作用后可见部分细胞核开始变形，颗粒感增强，细胞体积增大，胞浆减少；62.5 μg/ml浓度莪术油作用后可见细胞损伤明显加重，细胞核变形明显，多数细胞体积增大，胞浆明显减少，细胞界限模糊；125μg/ml浓度莪术油作用后可见核浆比例增大,细胞排列极性消失，颗粒感明显，细胞损伤非常明显，细胞质颗粒脱落，细胞核出现裂解，胞浆溶解，大量细胞碎片。本实验研究证实莪术油能够抑制人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖，并初步观察到细胞死亡的大体形态学变化，其具体的作用机制有待进一步探讨。
       【参考文献】
         　［1］ 丰有吉，沈 铿.妇产科学［M］.北京：人民卫生出版社，2005∶330.
       
       ［2］ 邓家刚，韦松基.广西道地药材［M］.北京:中国中医药出版社，2007：367.