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       【摘要】 
       目的探讨杜仲叶结构发育与绿原酸积累的关系。方法用高效液相色谱法测定了不同发育时期杜仲叶中绿原酸的含量，用石蜡切片法研究了杜仲叶的结构发育。结果在豫北地区，3月中旬杜仲叶萌动，4月上旬叶片分化完成表皮、栅栏组织、海绵组织和叶脉等成熟组织。7月叶片厚度达到最大,之后趋于稳定。4月叶片绿原酸的含量为0.654%，6月叶片中绿原酸的含量达到最高，为1.153%。之后，随着叶片的衰老，绿原酸含量不断降低，至落叶前的11月，绿原酸含量为0.483%。结论综合分析叶片生物量和绿原酸含量，7～8月份采集杜仲叶较合适。
       【关键词】  杜仲 叶 结构 绿原酸 高效液相色谱法 石蜡切片法
       杜仲Eucommia ulmoides  Oliv．为杜仲科(Eucommiaceae)杜仲属落叶乔木，为我国特产。杜仲皮是我国传统的中药材,具有补肝肾、强筋骨、安胎、降血压等功效。杜仲传统以皮入药,然而杜仲皮的生产年限较长，一般20年左右才能剥皮，药源远远不能满足需要。近年来有关学者在杜仲以叶代皮方面做了不少研究［1，2］，发现杜仲叶与杜仲皮药用成分的含量基本一致［2～4］，且药效相当，甚至有一些药用成分，如绿原酸，其叶中的含量高于皮中含量的5倍［5］。因此，杜仲叶不仅可以作为杜仲的新药源，而且可以作为保健品的新原料。绿原酸是杜仲叶中的重要成分［1，5］，具有利胆、抗菌、抗病毒、降压、增高白血球及兴奋中枢神经系统等多种药理作用，是保健、医药等工业的重要原料［5～7］。杜仲叶中的绿原酸的含量常作为评价杜仲叶品质的重要依据，而杜仲叶中绿原酸的产生与杜仲叶细胞发育有密切关系。本实验在对杜仲叶结构发育研究的基础上，用HPLC方法测定了杜仲叶中绿原酸含量［8～10］，探索了杜仲叶中绿原酸含量与杜仲叶结构发育之间的关系以及杜仲叶中绿原酸含量变化的规律，为杜仲叶的综合开发利用及最佳采叶时期的确定提供科学依据。
       1    器材
       1.1  药材本实验所用材料均取自河南师范大学生命科学学院生物园地(东经113°86"、北纬35°31")。
       1.2  仪器和试药仪器为美国Waters600高效液相色谱仪。Sep-pak C18柱，510泵，490可编程序紫外检测器，680梯度装置。绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所)。
       2  方法
       2.1  杜仲叶结构的观察从2006²04开始，每月取样1次，直到落叶前的11月。用于测定绿原酸含量的杜仲叶采摘后在室内自然风干，粉碎备用。用于切片的材料，取后立即用3%戊二醛固定液固定并保存，常规石蜡切片制片法制片，番红-固绿染色，Olympus显微镜观察组织结构，常规显微测量。
       2.2  绿原酸的含量测定采用高效液相色谱法。
       2.2.1  色谱条件流动相为乙腈（CH3CN）∶2%乙酸（HAC）水溶液（25∶75）；流速为1.0 ml/min；检测器波长分别为326 nm,254 nm；进样量1 μl。
       2.2.2  绿原酸的测定精确称取粉碎、过100目筛的杜仲叶样品2 g，加入150 ml 80%的甲醇水溶液，超声波振荡30 min，抽滤，其滤液置于25 ml容量瓶中，80%的甲醇水溶液定容。取出50 ml放入旋转蒸发器中蒸除甲醇，蒸至10～20 ml转至分液漏斗，以2N的盐酸酸化，加醋酸乙酯20 ml静置分层，下层水相重复用醋酸乙酯萃取3次，合并醋酸乙酯，加无水Na2SO4 脱水，滤除Na2SO4，滤液浓缩至干，然后加2 ml甲醇溶液溶解，取0.2 ml于活化的Sep-pak C18柱顶端，用80%的甲醇洗脱，收集前2 ml洗脱液作样品测定。
       3  结果
       3.1   杜仲叶生长发育中形态结构的变化杜仲叶横切面观察，杜仲叶片结构属于典型的中生性双子叶植物叶结构。叶片由表皮、叶肉和叶脉三部分组成。上表皮为一层细胞，排列紧密，长方形，外被角质层；上表皮下面是栅栏组织，栅栏组织也由一层细胞组成，细胞呈长圆柱形；栅栏组织下方是由3～4层细胞组成的海绵组织，海绵组织细胞内含有胶细胞，即海绵组织内含有胶丝。海绵组织细胞下面是下表皮，下表皮也由一层扁平细胞组成，下表皮分布有较多气孔。网状叶脉，其中主脉维管束外韧型，形成层明显。
       
       杜仲叶的结构在生长发育过程中随着月份变化也在不断变化(见表1)。4月份叶片厚度最小，角质层也最薄，结构分化不明显，栅栏组织，海绵组织没有分开，此后随着时间推移，叶片厚度增加，栅栏组织厚度、海绵组织厚度以及角质层的厚度都逐渐增加，到7月份各项指标都达到最大，栅栏组织，海绵组织分化最明显，而后直到11月份叶子落下都保持稳定。栅栏组织与海绵组织厚度的比值也是在4月份最小，5月、6月份逐渐增大，7月份达到最大，以后趋于稳定。表皮细胞所占叶片厚度的比例在4月份最大，以后逐渐变小，7月份以后趋于稳定。
       表1  不同生长时期杜仲叶解剖结构的特征（略）
       3.2  不同生长发育时期杜仲叶中绿原酸含量的变化叶片结构的变化与化学成分的变化有着密切的关系。杜仲叶中的绿原酸的含量随叶子生长而变化，在4～6月份绿原酸含量随叶片的生长发育而增加，绿原酸在叶中含量的最大值出现在植株生长最旺盛的6月份，叶片中绿原酸含量达到最高为1.153%，比年平均含量高出33.0%，然后又随着叶片生长进入衰老阶段，绿原酸含量逐渐下降，到叶落时达到最低为0.483%，比年平均含量低45.8%。结果见表2。
       表2  4～11月份杜仲叶中绿原酸的含量（略）
       4  讨论
       
       杜仲是我国特有的经济树种，在我国有大面积种植，每年杜仲叶产量约400万t。本研究结果显示，杜仲叶中含有丰富的杜仲皮指标成分绿原酸，可以作为杜仲的新药源和保健品的新原料。杜仲叶片结构的发育与绿原酸含量的变化有着密切的关系。叶片发育早期，随着栅栏薄壁组织、海绵薄壁组织等叶肉细胞的分化发育，杜仲叶片中绿原酸含量的不断增加。6月叶片组织结构发育成熟时叶片中绿原酸的含量达到最高。但此时采集叶片将严重影响杜仲树生长。之后，随着叶片的衰老，叶片中绿原酸的含量不断降低，7～8月绿原酸降低较慢，9月之后绿原酸迅速降低，至落叶前（11月）叶片中绿原酸的含量最低。综合分析叶片生物量和绿原酸的含量，7～8月份采集杜仲叶较合适。
       【参考文献】
         　　［1］ 李家实,阎玉宁. 杜仲皮与叶化学成分初步研究［J］.中药通报，1986，11：41.
       
       ［2］ 孙 波,陈 斌,杨晓燕,等. 杜仲叶与皮成分分析及药理实验［J］. 农牧产品开发，1997，6：20.
       
       ［3］ 刘军海,裘爱泳.杜仲叶中桃叶珊瑚苷提取工艺研究［J］.中成药，2007，29（2）：266.
       
       ［4］ 张康健,王 蓝,张风云，等. 杜仲叶与皮有效成分的比较研究［J］.西北林学院学报,1996,11：42.
       
       ［5］ 藏友维. 杜仲化学成分研究进展［J］.中草药,1992,22(4)∶42.
       
       ［6］ 肖培根.新编中药志，1卷［M］.北京：化学工业出版社，2001：259．
       
       ［7］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］．北京：化学工业出版社，2000：131．
       
       ［8］ 高致明,王太霞,喜进安. 杜仲叶在生长发育过程中化学成分含量和结构的变化［J］.河南农业大学学报，1997，31（2）：145.
       
       ［9］ 石少澜,王祝举,邵爱娟,等.高效液相色谱法测定杜仲皮中绿原酸的含量［J］.中国中药杂志，2005，5：715.
       
       ［10］ 万春花,倪永年,龙洲雄,等.反相液相色谱法测定杜仲叶中绿原酸［J］.食品科学，2007，1：255.