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       【摘要】 
       目的研究枸杞子多糖的提取及抗氧化活性。方法采用水提法提取枸杞子中的多糖，通过正交实验研究了固液比、提取温度、提取时间对枸杞子多糖提取得率的影响，并进行了提取次数实验。采用羟基自由基、超氧阴离子自由基体系，对枸杞子多糖的抗氧化活性进行了研究，并与维生素C进行了比较。结果确立了水提法提取枸杞子多糖的最佳工艺条件为提取温度80℃，固液比1∶30，提取时间3.5 h，提取2次。当多糖浓度达到229.5 μg/ml时，清除率达到48.1%，维生素C的清除率为41.2%。对超氧阴离子自由基的清除率低于维生素C，当多糖浓度达到229.5 μg/ml时，清除率达到13.5%，维生素C的清除率为48.6%。结论该方法简单、环保，枸杞子中多糖含量为8.34%。枸杞子多糖对这两种自由基均有不同的抑制作用。对羟基自由基的清除率高于维生素C。
       【关键词】  枸杞子 多糖提取 正交实验 抗氧化活性
       枸杞子为茄科（Solanaceae）植物枸杞Lycium chinense Mill的成熟果实，是我国传统的滋补中药材。《本草纲目》中记载枸杞子具有坚筋骨、补精气诸不足、明目安神、令人长寿等功效［1］。近年来的研究发现，植物多糖具有抗肿瘤、增强机体免疫力等功效，已是当前国内外研究的热点［2～5］。目前人们对枸杞子多糖进行了较广泛的研究，发现枸杞多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖、抗疲劳、护肝、防辐射、抗缺氧等功效［6～8］，同时对多糖的分离与纯化进行了一些研究［9，10］，但对提取的工艺条件研究较少。本文对影响枸杞子多糖提取因素进行了正交实验，优选出最佳的枸杞子多糖提取的工艺参数，同时进行了枸杞子多糖的体外抗氧化活性研究，以期为研究开发枸杞子多糖新的药物功能及保健食品提供基础数据。
       1    材料与方法
       1.1   仪器与试剂上海尤尼柯仪器有限公司产WFJ2100型分光光度计；上海安亭精密仪器厂产TDL80-28台式离心机；所用试剂均为分析纯试剂。
       1.2   药材  枸杞子，原产宁夏，购于大连开发区。
       1.3   枸杞子多糖的提取
       1.3.1   枸杞子多糖提取的工艺流程及方法在参考已有其它种类多糖提取方法［11］的基础上，利用水提的方法，采用正交实验对枸杞子多糖的提取条件进行优化，以确立最佳工艺条件。枸杞子多糖提取的工艺流程见图1。
       图1  枸杞子提取工艺流程示意图（略）
       
       准确称取已于70℃烘干并粉碎的枸杞子2 g于三角瓶中，按设计好的正交实验条件在恒温水浴中进行提取，然后将其以4 000 r/min离心18 min，得上清液，经浓缩，再加入5倍体积的乙醇，摇匀后，在4℃冰箱中放置过夜，以4 000r/min离心20 min。沉淀经干燥后得到粗多糖。采用硫酸－苯酚法［11］测定所提取的枸杞子多糖中多糖含量，然后根据所用枸杞子的质量（2g）计算出枸杞子中多糖得率。
       1.3.2   正交实验选用L9（33）正交实验，确定提取枸杞子多糖的最佳工艺参数，水平因素见表1。
       表1  正交水平（略）
       1.3.3  多糖含量测定采用硫酸-苯酚法测定提取的枸杞子多糖含量［11］，葡萄糖标准曲线的相关系数为0.998 8，线性方程为Y=0.007X。
       
       由标准曲线查出样品中多糖浓度，由下列公式计算样品枸杞子中多糖含量。
       
       多糖含量（%）=样品浓度×稀释倍数×样品体积多糖试样质量×100%
       
       枸杞子多糖得率（%）=计算测得多糖的质量枸杞子样品质量（2g)×100%
       1.4  体外抗氧化活性［12］
       1.4.1  羟基自由基体系利用Eenton体系测定枸杞子多糖对亚铁离子催化过氧化氢产生·OH的清除能力。由于·OH可特异地使番红花红褪色，根据褪色程度用比色法测量·OH含量。每支试管分别加入0.15 mol/L pH=7.4磷酸缓冲液1.5 ml，260 μg/ml番红花红0.2 ml。1.0 mmol/L EDTA- Na2-Fe2+ 0.7 ml，再分别加入一定浓度各级多糖试样1.0 ml,最后加入2％H2O20.8 ml，混匀后于37℃水浴保温30 min。空白以蒸馏水代替试样，对照组则以蒸馏水代试样和EDTA-Na2-Fe2+于520 nm测吸光度值，并以Vc作对比。
       
       清除率E（%）=（A样品-A空白）/（A对照-A空白）×100﹪
       1.4.2  超氧阴离子体系采用邻苯三酚自氧化法，在一定条件下，邻苯三酚能够自氧化产生·O2-，加入一定量的多糖液可对·O2-产生不同的抑制作用，进而导致光吸收值的变化。取0.05 mol/L pH 8.2 Tris-HCl缓冲液5 ml于试管中，分别加入1 ml一定浓度的各级多糖试样液，置于25℃水浴中预热20 min，再加3 mmol/L邻苯三酚0.4 ml，混匀，于25℃水浴中准确反应4 min，立即用浓HCl 0.5 ml终止反应，并在320 nm处测吸光度。空白对照组以相同体积Tris-HCl代替样品，每个试管做3个平行，取平均值，按下式计算清除率。
       
       清除率E（﹪）=（A对照-A样品）/A对照×100%
       2   结果与讨论
       2.1   枸杞子多糖提取
       2.1.1  正交实验结果正交实验提取的枸杞子多糖得率见表2。
       表2  正交实验结果（略）
       根据表2的极差分析可见，各因素对多糖得率的影响顺序为：B（温度） ＞C（提取时间） ＞A（固液比），说明在各因素中，水提温度对多糖提取率影响最大，然后是提取时间，最后是固液比。因素A，B以第2水平，C以第3水平为最好。因此，可确定枸杞多糖的提取优化条件为A2B2C3，即最佳提取温度为80℃，最佳提取时间为3.5 h，最佳固液比为1∶30。
       2.1.2   多糖提取次数实验称取枸杞子2 g，按正交实验优选的最佳工艺条件分别提取3次。实验结果见表3。
       表3  不同提取次数实验结果（略）
       由表3可以看出，第1次和第2次提取多糖得率较多，而第3次提取多糖得率较少，多糖得率不足0.1%，所以提取次数可选为2次。
       2.2   体外抗氧化活性
       2.2.1  羟基自由基清除测定枸杞多糖对羟基自由基的清除能力，同时与相应浓度的维生素C作对照,实验结果见图1。
       图1  枸杞子多糖与维生素C清除羟基自由基结果（略）
       
       由图1可见，对羟基自由基的清除作用，枸杞多糖的清除效果要好于等质量浓度的维生素C，当多糖浓度达到229.5 μg/ml时，其清除率达到48.1%,维生素C的清除率为41.2％。
       2.2.2   超氧阴离子清除测定枸杞多糖对超氧阴离子的清除能力，同时与等质量浓度的维生素C的对照。实验结果见图2。
       
       由图2可知，枸杞子多糖对超氧阴离子自由基的清除作用不明显，在实验浓度范围内其清除率随着多糖浓度的增加非常缓慢，维生素C的清除效果明显高于枸杞子多糖。当多糖浓度为75.5 μg/ml和229.5 μg/ml时，其对超氧阴离子自由基的清除率为13.4%和13.5%，相应浓度维生素C的清除率分别为36.5％和48.6％。
       图2  枸杞子多糖与维生素C清除超氧阴离子结果（略）
       3  结论
       
       由正交实验可见，在影响枸杞子多糖得率3个主要因素中，温度的影响最显著，其次为提取时间，最后为固液比。由正交实验可知,枸杞子多糖水浸提法提取的最佳工艺条件为提取温度80℃，固液比1∶30，提取时间3.5 h，提取次数为2次。在此条件下进行实验，枸杞子多糖得率为8.34%。对枸杞子多糖抗氧化活性研究表明，枸杞子多糖对羟基自由基的清除效果较好，其清除率高于维生素C，而对超氧阴离子自由基的清除率低于维生素C，在实验浓度范围内，其清除能力不随多糖浓度的增加而显著增高。
       【参考文献】
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