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       【摘要】 
       目的考察体外溶血实验葛根素注射液浓度对红细胞膜脆性的影响及与红细胞溶血率的相关性。方法用热诱导法考察50℃时葛根素注射液对Beagle犬红细胞膜脆性的影响；将不同浓度的葛根素溶液分别与Beagle犬红细胞、豚鼠红细胞在温度为37℃的生化培养箱内孵育6 h，于不同时间点观察各样品管的溶血程度，并于6 h后通过紫外分光光度计测定各管在波长540 nm处的吸光率，计算溶血率。结果高温条件下葛根素注射液可加剧Beagle犬红细胞溶血程度；葛根素注射液均能直接引起Beagle犬、豚鼠红细胞溶血，溶血率与葛根素浓度成明显的量效关系。结论葛根素注射液在一定浓度下可引起红细胞膜脆性增加；随着浓度的升高葛根素注射液的溶血作用更明显。
       【关键词】  葛根素注射液 红细胞 溶血率
       葛根素（Puerarin）广泛应用于缺血性心脑血管疾病的治疗。随着临床的广泛应用，发现该药有溶血反应、过敏反应和肝、肾损害等严重不良反应［1～10］。在国家药品不良反应监测中心病例报告数据库中，有关葛根素注射剂的严重不良反应报告以急性血管内溶血为主。葛根素注射剂导致急性血管内溶血具有发病急、进展快、病情危重的特点［11，12］。中国政府药品主管部门（药品食品监督管理局）已多次发出加强管理的通告，注意葛根素注射给药引起溶血的风险评价，并加强临床监控。在我们前期研究中发现，葛根素注射液在高浓度时，24条Beagle犬红细胞的溶血概率为70％左右。本研究通过体外溶血实验，探讨葛根素注射液对红细胞膜脆性的影响及葛根素注射液浓度对红细胞溶血率的关系。现报道如下。
       1  器材
       1.1  受试药物葛根素注射液，购自广州大日生物科技有限公司，批号01050801，规格：含50 mg/ml Puerarin。
       1.2  动物白化豚鼠，雌雄各半，体重250～400 g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：2003A002。饲养环境：室温25～27℃，相对湿度60%～78%。Beagle犬24只（体重6～8 kg，雌雄各半），由广东省医药工业研究所Beagle犬养殖场提供，合格证号：医动字0014298。饲养环境：室温25～27℃，相对湿度70%～80%。
       1.3  试剂及仪器氯化钠注射液（NS），批号：05112102，安徽华源生物药业有限公司生产；注射用水，批号：200508011，广州铁路中心医院生产；22XLJ-II型离心沉淀机，上海医用仪器厂；SPX－150B生化培养箱，上海康华生化仪器制造厂。
       2  方法［13］
       2.1   热诱导法考察葛根素注射液对红细胞膜稳定性的影响考察葛根素注射液对beagle犬RBC的影响：将6种浓度葛根素注射液（氯化钠注射液稀释）分别与0.05 ml 50%的beagle犬RBC悬液装于洁净试管中，混合，摇匀，置50℃生化培养箱保温30 min，同时设阴性(氯化钠注射液)及阳性(注射用水)对照管。育毕,置冰浴冷却，2 000 r/min离心10 min，吸取上清液,紫外分光光度计比色，于540 nm下测吸光度,计算RBC溶血率。溶血率（%）＝（样品管的吸光度－阴性对照管的吸光度）/（阳性对照管－阴性对照管的吸光度）×100%。计算平均溶血率，结果见表1及图1。
       2.2   葛根素注射液对红细胞的溶血作用
       2.2.1   葛根素注射液对Beagle 犬红细胞的溶血作用取狗血10 ml，用牙签不断挑去纤维蛋白原，成脱纤血，用NS稀释，摇匀，离心，弃上清液。沉淀的红细胞再用NS反复洗涤2～3次，至离心后上清液无色。将所得红细胞按其体积用NS配成2％悬液（当天使用，使用时摇匀）。取试管6支，标号。①～④号管分别加入5％的葛根素注射液0.1，0.2，0.4，0.8 ml，加NS稀释至2.5 ml，涡旋15 s使其充分溶解。各管葛根素终浓度分别为：1，2，4，8 mg/ml。5号加2.5 ml的NS（做阴性对照管）；上述5管与2％的红细胞悬液2.5 ml混合，摇匀。6号管加入2％的红细胞悬液2.5 ml，离心，除去NS，加注射用水溶解至5 ml，摇匀，作为阳性对照管。将各管置于37℃恒温箱孵育6 h。然后观察各管的溶血程度及血细胞的凝集；取上清液，离心，用紫外分光光度计于波长540 nm下测定吸光度（OD值）。按公式：溶血率（％）＝（样品管OD值－阴性对照管OD值）/（阳性对照管OD值－阴性对照管OD值）×100%，计算各管的溶血率。此实验用不同Beagle 犬细胞重复4次，求4次结果的平均值。结果见表2及图2。
       2.2.2  葛根素对豚鼠红细胞的溶血作用取健康豚鼠6只，心脏采血3ml，用肝素抗凝。1 500 r/min离心10 min，除去血清，用NS稀释，摇匀，离心，弃上清液。沉淀的红细胞再用NS反复洗涤2～3次，至离心后上清液无色。所得红细胞按其体积用NS配成50％悬液（当天使用，使用时摇匀）。每例动物血样取试管8支做实验，标号。1～6号管分别加入5％的葛根素注射液0.025，0.05，0.1，0.15，0.20，0.25 ml，加NS稀释至2.45 ml，涡旋15 s使其充分溶解。各管葛根素终浓度分别为：0.5，1，2，3，4，5 mg/ml。7，8号分别加NS、注射用水2.45 ml作阴性及阳性对照管。上述8管均加入豚鼠50%红细胞悬液0.05 ml并混匀，置入37℃恒温箱孵育6h，然后观察各管的溶血程度及血细胞的凝集；取上清液，离心，于540 nm下测定吸光度（OD值）。按公式：溶血率（％）＝（样品管OD值－阴性对照管OD值）/（阳性对照管OD值－阴性对照管OD值）×100%，计算豚鼠红细胞加入不同浓度葛根素试液孵育后的平均溶血率。结果见表3及图3。
       3  结果
       3.1   高温下葛根素注射液对红细胞膜稳定性的影响结果见表1及图1。
       表1  高温下不同浓度的葛根素注射液对Beagle 犬红细胞的溶血作用（略）
       图1  高温不同浓度葛根素注射液对Beagle犬红细胞溶血率的影响（略）
       
       结果显示：热诱导下，不同浓度的葛根素注射液均能加速红细胞的破损，随着浓度的增大红细胞的溶血率显著增大，相关系数r=0.959 7。提示高温条件下葛根素注射液可降低红细胞膜的稳定性，导致溶血率增大。
       3.2   葛根素注射液对不同动物红细胞的溶血作用结果见表2～3及图2～3。
       表2  不同浓度的葛根素注射液对Beagle 犬红细胞的溶血作用（略）
       图2  不同浓度的葛根素注射液对Beagle犬红细胞的溶血作用（略）
       表3  不同浓度的葛根素注射液对豚鼠红细胞的溶血作用（略）
       图3  不同浓度的葛根素注射液对豚鼠红细胞的溶血作用（略）
       
       葛根素注射液均未引起Beagle 犬红细胞和豚鼠红细胞出现凝集现象，但一定浓度下可引起明显溶血。以上结果显示：葛根素对Beagle 犬红细胞和豚鼠红细胞的溶血作用结果相同，溶血程度与葛根素浓度呈一定的剂量相关性（相关系数r分别为0.961 4和0.922 7）。当体外葛根素浓度>2 mg/ml时，豚鼠红细胞的溶血率>5%，而Beagle 犬红细胞溶血率达到24.5%，这可能与不同种属动物的红细胞对葛根素的敏感性不一有关。随着浓度的增大，Beagle 犬、豚鼠红细胞溶血率均可达到50%以上，高浓度的葛根素试液对红细胞的溶血作用较为明显。实验结果提示，葛根素的溶血作用与药物的浓度密切相关，高浓度时易引起溶血；临床用药应注意葛根素注射液使用剂量及监测血药浓度不宜过高。
       4  讨论
       
       葛根素注射液系按照化学药物标准生产、管理的中药注射液，物质基础明确，可控成分在99%以上，生产工艺成熟，产品质量稳定，是中药西制的成功范例。但近来发现，葛根素注射液可引起急性血管内溶血，大大限制了它的临床应用。针对葛根素注射液的不良反应，开展了大量研究工作。文献报道可能由辅料、免疫或制剂等原因引发溶血，但未有确切的实验数据和理论能够阐明不良反应的机理，更谈不上行之有效的预防和治疗葛根素不良反应的方法。临床医生只好慎用或不应用。因此，阐明葛根素注射液不良反应产生的机理，才有可能解决葛根素注射液的不良反应，保证用药安全。
       
       前期体外溶血实验，我们排除葛根素注射液pH值、辅料丙二醇对红细胞溶血率的影响，因此开展研究葛根素直接致红细胞溶血的研究。本次实验结果显示：高温下葛根素注射液可加剧红细胞膜稳定性下降；葛根素注射液浓度与红细胞溶血率呈良好的相关性；不同种属动物的红细胞对葛根素的敏感性不一。高浓度的葛根素注射液致溶血的危险性更高，提示临床用药应控制用量并密切关注肝肾功能不全患者的血药浓度，避免严重不良反应的发生。
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