文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的探讨羟基积雪草苷（madecassoside，MC）的舒张血管作用及其机制。方法采用离体大鼠胸主动脉张力实验观察MC的舒张血管作用。结果MC使去甲肾上腺素（NE）和氯化钾（KCl）收缩动脉条的量效曲线右移，最大收缩力降低；并对NE诱导的细胞内Ca2+释放所引起的收缩有明显的抑制作用；但去除血管内皮细胞后MC反而使动脉条收缩进一步增强；在有一氧化氮合酶(NOS)抑制剂存在的情况下，其抑制NE收缩的效应消失；对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）收缩动脉条的量效曲线无明显影响。结论MC有明显的舒张血管作用，表现为钙拮抗活性，以抑制细胞内Ca2+释放为主；且通过内皮细胞发挥作用，并与一氧化氮（NO）合成通路有密切的关系。
       【关键词】  羟基积雪草苷 去甲肾上腺素 一氧化氮合酶抑制剂 内皮细胞 胸主动脉
       中药积雪草是伞形科植物积雪草Centella asiatica (L.) Urban的干燥全草，为各版《中国药典》收载品种，其主要活性成分为三萜皂苷类。有报道积雪草总苷具有抗溃疡［1］、治疗皮肤疾病［2］、抗焦虑［3］、免疫调节和诱导凋亡［4，5］等多种作用。
       
       羟基积雪草苷(madecassoside，MC)是积雪草三萜皂苷类的主要成分之一。有关MC单体对心血管方面的作用未见报道。在本实验室前期研究中发现MC对NE预收缩的离体大鼠胸主动脉条有一定的舒张作用，但其作用机制尚不明确。利用离体动脉条模型，进一步探讨MC舒张血管的作用及其机制，为开发此类化合物提供一定的实验依据。
       1  材料
          
       MC（军事医学科学院放射与辐射医学研究所样品库）；重酒石酸去甲肾上腺素注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批号0403311）；氯化乙酰胆碱（Acetylcholine Chloride，ACh，Sigma公司分装）；血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Sigma公司，批号064K51201）；L-N-硝基精氨酸甲酯（Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrocholoride，L-NAME，Sigma公司，批号124K1212）；其它试剂均为分析纯，由军事医学科学院供应科提供。Krebs-Henseleit（K-H）液（mmol·L-1）配方：NaCl 133，KCl 4.75，MgCl2 1.25，CaCl2 1.5，NaHCO3 25，葡萄糖11.1，pH值7.4；无钙K-H液为正常的K-H液无CaCl2成分，加入0.01 mol·L-1EGTA。
       
       清洁级Wistar大鼠，雌雄兼用，体重180～220 g，由军事医学科学院实验动物中心繁殖。
       
       恒温灌流仪（北京军事医学科学院实验仪器厂，HX-10555）；张力换能器（高碑店市新航机电设备有限公司，JZ101）；MadLab生物医学信号采集处理系统（南京美易科技有限公司）。
       2  方法
       2.1  大鼠胸主动脉条的制备［6］取大鼠，麻醉后开胸迅速取出胸主动脉，将其剪成4～9 mm的环段，置于含10 ml K-H液的浴槽内，保持37 ℃并持续通入体积分数为95% O2和5% CO2的混合气体，前负荷为1.0 g，平衡1～2 h后开始实验，肌条张力通过张力换能器记录于生物医学信号采集处理系统。
       2.2  对NE，KCl和AngⅡ收缩曲线的影响  累积浓度法作NE（10-9～10-5 mol·L-1）量效曲线，K-H液反复冲洗动脉条至张力恢复正常，加入MC作用10 min，在有MC存在的情况下重复上述NE的量效曲线，前后对照统计，MC分为0.02，0.04，0.08，0.16 mmol·L-1剂量组。同法作KCl（0.01 ～ 0.16 mol·L-1）和AngⅡ（10-11～10-6mol·L-1）量效曲线。
       2.3  对NE诱导动脉条两相收缩的影响  标本于K-H液中平衡1～2 h，无钙K-H液反复冲洗30 min后，加入NE 10-7 mol·L-1引起动脉条第一相收缩，收缩稳定后加入CaCl2，以恢复无钙K-H液中的Ca2+浓度（1.5 mmol·L-1），引起第二相收缩，直至收缩达高峰坪值，两相收缩幅度之和作为100%，分别计算两相收缩所占收缩率。无钙K-H液反复冲洗标本，待其张力恢复正常后，加入MC作用10 min，在有MC存在的情况下重复上述过程，前后对照统计。MC分为0.02，0.04，0.08 mmol·L-1剂量组。
       2.4  对内皮完整动脉条及去内皮动脉条作用的比较  机械摩擦法去除动脉条内皮细胞，加入ACh 10-6～10-4mol·L-1检测内皮细胞活性，无内皮动脉条加入ACh后，无舒张效应。同一动物获得的动脉条分别制作保留内皮与去内皮两组标本，作为平行对照。两组标本分别加入NE（10-7mol·L-1）使动脉条收缩达高峰坪值（Emax），累积浓度法加入MC 0.02，0.04，0.08 mmol·L-1，记录各浓度所对应的收缩幅度（E），采用(Emax-E） / Emax × 100%分别计算各浓度MC的收缩抑制率。
       2.5  一氧化氮合酶抑制剂对MC舒血管作用的影响［7］加入NE（10-6mol·L-1）待收缩达高峰坪值（Emax），加入MC 0.08 mmol·L-1，记录加入MC后各时段张力值；冲洗标本，待张力回到基线后，加入NOS抑制剂L-NAME（10-4mol·L-1）5 min后重复上述加入NE及MC的过程，记录相应收缩幅度（E）。分别用公式：收缩率=E / Emax × 100%计算样本在两种条件下的收缩率。同时设空白对照组，观察激动剂NE收缩持续时间，以保证考察MC的舒张作用是在其平稳收缩范围内。
       2.6  统计分析  运用OriginPro7.0软件拟合量效曲线求出PD2，实验结果以(±s)表示，运用SPSS11.5软件进行统计处理，组间显著性检验采用t检验。
       3  结果
       3.1  对NE，KCl和AngⅡ收缩曲线的影响MC可以使NE和KCl量效曲线PD2减小，最大收缩力降低，曲线非平行右移。0.02，0.04，0.08 mmol·L-1组分别使KCl量效曲线的PD2由（1.46±0.06）减至（1.39±0.05），（1.38±0.05），（1.35±0.09），0.04，0.08 mmol·L-1组最大收缩力由（1.56±0.26）g降至（1.32±0.17）g，（1.28±0.20）g，与对照组相比均有统计学差异（P<0.05），结果见表1和图1。
        对AngⅡ量效曲线的PD2及最大收缩力均无明显影响（P>0.05）。结果见表2。
       表1  MC对NE收缩大鼠胸主动脉条量效曲线的影响（略）
       与NE对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；n=10
       与KCl 对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；n=10
       图1  MC对KCl收缩大鼠胸主动脉条量效曲线的影响（略）
       表2  MC对AngⅡ收缩大鼠胸主动脉条量效曲线的影响（略）
       与AngⅡ对照组比较，*P＜0.05；n=8
       3.2  对NE诱导动脉条两相收缩的影响MC抑制细胞内Ca2+释放引起的收缩（P<0.05）；但对细胞外Ca2+内流引起的收缩并无明显抑制作用（P> 0.05）。结果见表3。
       表3  MC对NE引起的内Ca2+释放和外Ca2+内流两相收缩的影响（略）
       与NE对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；n=10
       3.3  对内皮完整动脉条及去内皮动脉条作用的比较在内皮完整动脉条中MC可抑制NE引起的收缩，收缩抑制率逐渐增大；去内皮组：MC使动脉条收缩增强，收缩抑制率均为负值，各剂量组分别与内皮完整组比较有显著性差异（P<0.001）。结果见表4。
       表4  MC对内皮完整和去内皮大鼠胸主动脉条作用的比较（略）
       与相应的内皮完整组比较，***P<0.001；n=10
       3.4  一氧化氮合酶抑制剂对MC舒血管作用的影响MC可抑制NE（10-6 mol ·L-1）引起的收缩（P<0.001），当加入L-NAME后使收缩率增至（128.8 ± 14.8）%，与NE对照组相比有统计学差异（P<0.001），但在L-NAME存在的情况下再次加入等剂量MC，不表现出明显的舒张作用，与（NE + LNAME）组相比无显著性差异（P>0.05），结果见图2。
       图2  L-NAME对MC舒张大鼠胸主动脉条作用的影响（略）
       4  讨论
       
       高浓度的钾使血管平滑肌细胞膜去极化，细胞内Ca2+浓度增加，引起血管收缩。MC非竞争性抑制KCl的缩血管作用，表明MC的舒血管作用与抑制肌细胞内Ca2+增多有关。
       
       NE通过α受体激活受体操纵钙通道(ROC)引起血管收缩，这种收缩既有细胞外Ca2+内流的作用，也有细胞内钙储存池Ca2+释放的参与。MC对NE的缩血管作用表现为非竞争性抑制，表明MC不是与α受体竞争性作用，可能是改变了与Ca2+有关的平滑肌收缩活性。对血管平滑肌两相收缩成分的分析显示，MC抑制细胞内Ca2+释放为主，从而引起舒张效应。以上结果说明MC具有一定的钙拮抗作用。
       
       血管内皮细胞在调解血管张力方面起着非常重要的作用，因此实验中考察了内皮细胞对MC舒张血管作用的影响。结果发现，MC依赖内皮细胞发挥舒张血管作用，去除内皮后MC反而表现出收缩血管效应。因此进一步探讨与内皮相关的肾素-血管紧张素系统及NO合成调节通路。实验结果表明MC可能不是直接通过抑制AngⅡ而舒张血管的；根据预实验及相关文献报道［8］，应用一氧化氮合酶抑制剂 L-NAME 10-4mol·L-1可有效阻断NO的合成。实验中应用此浓度的L-NAME，取消了MC的舒张血管作用。结果提示：MC通过内皮细胞发挥舒张血管作用，而且与NO合成通路密切相关。
       
       综上所述，羟基积雪草苷具有舒血管活性，其作用机制：具有钙拮抗作用，并以抑制细胞内Ca2+释放为主；舒张血管作用具有血管内皮依赖性，且与NO合成通路有关。其确切机制有待进一步研究探讨。
       
       致谢：本项研究在北京军事医学科学院，放射与辐射医学研究所完成，得到了任建平、郭绍明、温利青老师的耐心指导与大力帮助，向他们表示真诚的谢意。同时感谢组里其他各位老师、同学给予的帮助和支持。
       【参考文献】
         　［1］ Chen Lung-cheng, Jin Sheng-guo, Luk J, et al. The healing effects of Centella extract and asiaticoside on acetic acid induced gastric ulcers in rats［J］.Life Sciences, 2004, 74(18): 2237.
       
       ［2］ Sampson JH, Raman A, Karlsen G, et al. In vitro keratinocyte antiproliferant effect of Centella asiatica extract and triterpenoid saponins［J］.Phytomedicine, 2001, 8(3): 230.
       
       ［3］ Chen Si-wei, Wang Wen-juan, Li Wei-jing, et al. Anxiolytic-like effect of asiaticoside in mice［J］.Pharmacology Biochemistry and Behavior, 2006, 85(2): 339.
       
       ［4］ Jayathirtha MG, Mishra SH. Preliminary immunomodulatory activities of methanol extracts of Eclipta alba and Centella asiatica［J］.Phytomedicine, 2004, 11(4): 361.
       
       ［5］ Huang YH, Zhang SH, Zhen RX, et al. Asiaticoside inducing apoptosis of tumor cells and enhancing anti-tumor activity of vincristine［J］.Chin J Cancer, 2004, 23(12)：1599.
       
       ［6］ 徐叔云，卞如濂，陈 修. 药理实验方法学，第3版［M］.北京：人民卫生出版社，2002：1070.
       
       ［7］ Mizuno O, Hirano K, Nishimura J, et al. Mechanism of endothelium-dependent relaxation induced by thrombin in the pig coronary artery［J］.Eur J Pharmacol, 1998, 351(1)：67.
       
       ［8］ Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: Physiology, pathophysiology and pharmacology［J］. Pharmacological Reviews, 1991, 43(2)：109.