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       【摘要】 
       目的通过建立阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease,AD）大鼠模型,观察脑益康对AD大鼠学习记忆能力、β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein, β-APP）裂解途径的影响，探讨脑益康改善AD模型大鼠症状的机制。方法采用β淀粉样蛋白毒性片段－(β-amyloid protein25－35，Aβ25－35)海马注射建立AD大鼠模型,用电迷宫刺激器检测大鼠学习记忆能力；免疫组织化学方法观察大鼠脑组织Aβ40/42表达的变化；逆转录－聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction ,RT-PCR）方法检测大鼠海马β-APPmRNA表达情况；Western-Blot方法测定大鼠皮层组织β位点剪切酶（β-amyloid precursor protein cleaving enzyme，BACE1）的表达。结果脑益康能提高AD模型大鼠的学习、记忆能力；抑制AD大鼠脑组织Aβ40/42的生成；下调 AD大鼠海马β-APPmRNA的表达；减少AD大鼠脑皮层内BACE1蛋白的含量。结论脑益康减少脑内Aβ的沉积可能是通过抑制BACE1从而下调β-APP的表达而实现的。
       【关键词】  阿尔茨海默病 脑益康 学习记忆 β淀粉样蛋白 β淀粉样前体蛋白 β-分泌酶
       阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease,AD）又称老年性痴呆，是一种以记忆力减退、认知功能障碍为特征的中枢神经系统变性疾病，其主要病理学特征之一是脑组织特别是海马区出现大量老年斑（Senile plaque,SP）［1］。研究发现β淀粉样蛋白(β-amyloid protein ,Aβ)是SP的主要毒性成分。Aβ主要来源于β淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein, β-APP）的裂解，β-APP在水解产生Aβ的过程中涉及3种分泌酶，分别是α，β和γ-分泌酶，其中β-分泌酶（β-amyloid precursor protein cleaving enzyme,BACE1）在生成Aβ的过程中起到了关键性的作用［2］，被认为是防治AD药物的重要靶点。脑益康由制首乌、巴戟天等组成，有效成分多，药理作用广泛，可多系统、多层次、多途径、多靶点的发挥药理作用。本实验采用Aβ25－35微量注射入大鼠海马建立AD大鼠模型，观察脑益康对AD大鼠学习记忆能力、脑内Aβ的生成、β-APPmRNA以及β-APP裂解途径中关键酶－BACE1表达的影响。
       1  材料与仪器
       1.1  动物 雄性SD大鼠，SPF级，体重（230±10）g，由南通大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(苏)2002-0022。标准鼠饲料常规喂养。
       1.2  药物与试剂 脑益康由制首乌、巴戟天等组成（南通市中医院制剂室制成颗粒剂，每克颗粒含生药1.98 g）；脑复康（吡拉西坦片，南京白敬宇制药厂生产，批号20050812）；Aβ25－35（Sigma公司，美国）；Rabbit anti-human beta-amyloid 1-40/42 polyclonal antibody(CHEMICON公司)；BACE1抗体 (北京博奥森生物技术有限公司)；山羊抗兔IgG免疫组化试剂盒（北京中衫生物工程有限公司，批号：SP9001）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒﹑免疫印迹化学发光试剂（BeyoECL Plus）（均购自海门碧云天生物技术研究所）。
       1.3  仪器 大鼠脑立体定位仪（美国Stoelting公司）；Y-型（MG-B型）迷宫刺激器（张家港市三兴教学机械厂）；冰冻切片机（LAICA CM1900，德国）；PTC-100PCR仪（美国Bio-rad公司）；Mini protein-3电泳装置（美国Bio-rad公司）；Trans-blot转印槽（美国Bio-rad公司）。
       2  方法
       2.1  分组、造模与给药 用电迷宫刺激器筛选出学习记忆能力正常的SD大鼠48只，随机分为6组：假手术组，模型对照组及阳性药脑复康（0.4 g·kg-1·d-1）对照组，脑益康小、中、大剂量组（1.73，3.45，6.90 g·kg-1·d-1）。其中，脑益康中剂量相当于临床用量，每组8只。将大鼠用10％水合氯醛（4 ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪，颅顶部剪毛，碘酒和酒精消毒后，无菌条件下切开皮肤，分离颅骨外骨膜，显露前囟，记录前囟A（矢状轴）、L（冠状轴）、V （垂直轴）的坐标，参照《大鼠脑立体定位图谱》确定右侧海马CA1区位置，定位坐标：前囟后3.0 mm，中线右侧2.0 mm，硬膜下4  mm，在颅骨定位处钻一小孔，缓慢垂直进针至靶点，然后将5 μl Aβ25－35(用生理盐水将冻干粉状Aβ25－35稀释成2 μg·μl-1,37℃下孵育1周，使其变为聚集态的Aβ25－35）缓慢注入，注射速度为0.5 μl·min-1，留针5 min，以保证溶液充分弥散，再缓慢撤针，无颅内出血后缝合皮肤。假手术组注射等量生理盐水，余操作同前。所有操作均在无菌条件进行，手术后大鼠分笼饲养。于术后第2天开始灌胃给药，1次/d，给药容量为0.1 ml·kg-1，脑复康脑益康均由0.5％羧甲基纤维素钠配制灌胃，假手术组给予生理盐水，模型对照组给予溶剂，连续30 d。
       2.2  迷宫刺激器实验Y-型迷宫刺激器为三等臂式电迷路箱，三臂（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）间的夹角为120°，臂长48 cm，宽16 cm，高19 cm，各臂末端均装有信号灯。箱底铺设铜栅，供通电刺激用。通过控制器开关，可使三臂交替作为安全区（不通电，灯亮）。于用药30 d后测试大鼠的学习、记忆能力。实验固定在上午8：00～12：00进行，保持周围环境安静，避免强光刺激。将大鼠放入迷宫刺激器的一臂，适应环境3 min后给予电刺激（60 V，持续2 s）。其余两臂中的任一臂给予灯光信号，示为安全区。大鼠进入安全区，为正确反应，否则为错误反应。第2次训练以此安全区作为起步区，并使大鼠停留在安全区1 min以巩固记忆。再次给予电刺激，以此类推，按方向（Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ）依次改变安全区位置。学习测试：以测试达到连续10次中有9次（9/10）正确反应前所需的电击次数即尝试次数表示学习能力。记忆再现测试：学习测试完成24 h后以同样方法进行，以达到9/10标准前的尝试次数表示记忆能力。
       
       2.3  取材方法和样品制备 将大鼠用20％水合氯醛腹腔麻醉后，剪开胸腔，暴露心脏，从左心室插灌注针至升主动脉，用眼科剪剪开右心耳。先快速灌注生理盐水150 ml至流出液清亮，再灌注预冷的4%多聚甲醛500 ml（先快后慢于1 h内灌注完）。灌注结束后迅速断头取脑，去除小脑和嗅球，4%多聚甲醛中后固定6～8h。将全脑依次移入含20%和30%蔗糖的磷酸盐缓冲液中进行梯度固定，置于4 ℃冰箱中至组织块沉烧杯底。取实验所需部位于恒冷切片机中在-20 ℃下冰冻连续切片，片厚30 μm。
       2.4  免疫组织化学染色 按免疫组化SP试剂盒方法进行Aβ40/42免疫组织化学染色，以0.01M PBS代替一抗做阴性对照，Aβ40/42免疫阳性细胞在光镜下胞质和突起内有棕黄色阳性颗粒，计数每张切片4个随机高倍视野中阳性细胞数取平均值作为计数结果。
       2.5  β-APPmRNA表达检测 用Trizol试剂提取新鲜海马组织总RNA，以β－actin为内参照，RT-PCR法测定待测的mRNA相对表达量。用凝胶成像系统分析PCR产物电泳条带光密度值，表达水平以待测mRNA与β－actin mRNA的光密度值之比来表示。APP的引物为：上游5’－GGATGCGGAGTTCGGACATG－3’，下游5’－GTTCTGACTCTGCTCAAAG－3’，产物为297 bp。β－actin的引物为：上游5’－GAGACCTTCAACACCCCAGCG－3’，下游5’－TCGGGGCATCGGAACCGCTCA－3’,产物为404 bp。
       2.6  BACE1的Western-blot法检测 取大鼠新鲜皮层脑组织提取蛋白后，用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，取10 μg进行SDS－PAGE电泳，先在100 V电泳20 min，然后150 V电泳至溴酚蓝抵达胶底后20 min结束电泳，而后在350 mA的条件下转膜150 min，将蛋白质转移到PVDF膜上 ，5％脱脂牛奶室温包被2 h，加入1∶300多克隆兔抗BACE1和1∶2 000多克隆兔抗β－actin 4 ℃过夜；加入生物素化的二抗室温孵育2 h，ECL显影和图象扫描。
       2.7  统计学处理 所有数据利用Stata10.0统计软件进行处理，进行方差分析和两两比较，各组数据均以±s表示，以P<0.05为有统计学意义。
       3  结果
       3.1  脑益康对各组大鼠学习记忆能力的影响Y型迷宫刺激器实验显示大鼠海马CA1区注射Aβ25－3530 d后，模型对照组大鼠触电时间比假手术组显著延长（P<0.01）。脑益康各剂量组和脑复康组触电时间均比模型对照组缩短（P<0.01），而脑益康各剂量组、脑复康组与假手术组比较，触电时间无明显差别（P>0.05）。模型对照组大鼠正确反应次数比假手术组显著减少（P<0.01）。脑益康各剂量组和脑复康组大鼠正确反应次数多于模型对照组（P<0.05），脑益康各剂量组﹑脑复康组与假手术组比较，正确反应次数无显著性差异（P>0.05）。结果见表1。
       表1  各组大鼠迷宫刺激器实验触电时间和正确反应次数的变化（略）
       与假手术组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.05，##P<0.01；n=8
        
       3.2  脑益康对AD模型大鼠海马区Aβ40/42沉积的影响Aβ40/42免疫组织化学染色结果显示，Aβ40/42蛋白免疫反应产物为棕黄色细颗粒状，位于细胞膜和细胞浆，细胞核为阴性。阳性细胞主要集中分布在海马CA1区的锥体细胞层。与假手术组相比，各组大鼠海马区阳性神经细胞数明显增加（P<0.01）；而与模型对照组相比，脑复康组和脑益康各剂量组阳性神经细胞数明显减少（P<0.01）。结果见表2。
       表2  各组大鼠海马组织Aβ40/42的阳性神经细胞数（略）
       与假手术组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，##P<0.01
       3.3   脑益康对AD模型大鼠脑海马内β-APPmRNA表达的影响抽提大鼠海马总RNA，APP引物与β-actin同时进行RT-PCR，PCR产物琼脂糖凝胶电泳，可见扩增出了297 bp（APP）和100 bp（β-actin）条带。图象分析结果显示，各组海马组织APP的条带表达与假手术组比均明显增高(P<0.01)；但与模型组相比，脑复康对照组、脑益康中剂量组和脑益康大剂量组条带表达均明显减少(P<0.01)，而小剂量组则减少不明显（P>0.05）。表明AD模型大鼠脑皮层β-APPmRNA表达显著增高，而脑益康能够抑制这种变化。结果见表3。
       表3  各组大鼠海马组织β-APPmRNA的表达（略）
       与假手术组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，##P<0.01；n=6
       3.4   脑益康对AD模型大鼠脑皮层内BACE1蛋白表达的影响Western-Blot法检测大鼠脑皮层组织BACE1表达的结果显示，在70KD处可见BACE1的表达，各组BACE1的表达水平与假手术组比较均显著增加（P<0.01）。与模型对照组比较，脑益康中剂量组和大剂量组明显减少（P<0.01）,而脑复康对照组、脑益康小剂量组有减少的趋势，但无统计学意义（P>0.05）。结果见表4。
       表4  各组大鼠脑皮层组织BACE1的表达（略）
       与假手术组比较，**P<0.01；与模型对照组比较，##P<0.01；n=6
       4  讨论
       
       目前供实验研究用的拟AD动物模型种类较多，但与临床和病理表现完全吻合的模型还未被发现。本实验采用凝聚态Aβ25－35海马区立体定位注射建立AD大鼠模型。Aβ25－35是Aβ的毒性效应片断，其凝聚状态对神经毒性有决定作用，为了使Aβ25－35更好地在脑内弥散沉积，在使用Aβ25－35微量注射前先将它置于37℃下孵育7 d，使Aβ25－35在体外充分聚集，以凝聚状态进行海马定位注射, Aβ在AD发病机制中起核心作用，而且凝聚态的Aβ25－35的聚集性好，能够更好地沉积在脑局部，产生毒性作用，这样建立的大鼠模型更加接近临床的病理变化。造模后行为学测试显示模型对照组大鼠的触电时间明显长于NS对照组大鼠，而前者的正确反应次数比后者显著减少，表明大鼠的学习记忆能力下降，这说明该造模方法是成功的。造模后用不同剂量脑益康和脑复康治疗30 d后，再次检测各组大鼠的学习记忆能力，发现各治疗组的学习记忆能力与模型对照组相比均得到明显改善，说明脑益康能提高AD模型大鼠的学习记忆能力。
       
       大量研究表明，脑中Aβ的过度沉积在神经细胞变性过程中起中心作用［3］。AD的两大病理改变是老年斑（senile plaque，SP）和神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles ，NFT），目前SP和NFT的关联和在AD中扮演的角色还存在争议，但已有证据［4］显示Aβ的聚集是AD发病的始发事件，而且AD的其他病理特征如tau蛋白的高度磷酸化以及随后的NFT的形成等都与Aβ生成及其清除的失衡有关。异常Aβ的神经毒性主要表现在能破坏钙平衡，产生大量的氧自由基，增强谷氨酸毒性，诱导产生一氧化氮，诱导神经凋亡和中枢神经系统炎症反应。海马和皮质是学习记忆的关键部位,也是最易受Aβ毒性损害的区域。由于AD患者大脑海马、皮质等内有大量的Aβ的沉积, 神经元变性、死亡，而其中Aβ沉积量的多少与AD 发生发展有重要关系。所以Aβ通常可以作为评价实验效果的指标之一。Aβ是一种难溶的蛋白质，由40～42个氨基酸残基组成，由APP裂解产生［5，6］。APP蛋白半衰期短，由蛋白酶通过α和β两条途径迅速代谢。α途径由于切割位点位于Aβ区域内，所以不产生Aβ，而在病理情况下，非Aβ途径受抑制，Aβ途径被激活，β途径先由BACE1在671和672残基间切割，继而再由γ分泌酶在712残基附近切割而产生Aβ［7］。BACE1不仅起始了APP的淀粉样酶切途径，也是Aβ生成的限速酶［2］，故BACE1的过度表达可以增加APP在β位点的裂解，而BACE1的下调则可以减少Aβ的分泌。所以任何影响APP和BACE1的表达及活性都会影响Aβ的生成与清除的平衡，从而导致Aβ的产生异常，促进AD的病理改变的形成［8］。
       
       本实验采用免疫组织化学方化法检测Aβ40/42在AD大鼠海马区中的沉积，结果表明脑益康对AD模型大鼠脑组织中Aβ40/42的沉积有减少作用，而Aβ的异常沉积则与AD模型大鼠脑内APP的异常代谢密切相关。本实验检测了AD模型大鼠脑内β-APPmRNA的水平，结果发现脑益康能下调β-APPmRNA的水平，表明脑益康能够在基因转录水平抑制AD模型大鼠脑内β-APPmRNA的过度表达。这一结果与脑益康使得AD模型大鼠脑内Aβ40/42异常沉积的减少相平行，说明Aβ途径被抑制。在此基础上，本研究又从蛋白水平检测了AD模型大鼠脑内BACE1的表达情况，结果显示脑益康能够减少AD模型大鼠脑内BACE1的蛋白表达，故特异性的剪切APP的过程受抑。以上结果说明脑益康对AD的治疗作用是通过降低BACE1的表达与活性，选择性的使APP通过Aβ途径的裂解减少，使得Aβ40/42生成减少，减轻神经元的毒性，减轻AD的病理变化而实现的，从而达到防治AD的目的。但是在BACE1参与的APP裂解成Aβ的过程中，具体的信号转导机制以及还有哪些因素参与了这个过程还有待进一步的研究。
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