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       【摘要】 
       目的探讨金银花解热作用的中枢机制, 为其在临床应用提供实验依据。方法用白细胞介素-1β（IL-1β）复制新西兰兔发热模型, 在观察金银花解热作用的基础上, 应用免疫组化技术检测静脉注射金银花对IL-1β作用下新西兰兔视前区-下丘脑前部(preoptic anterior hypothalamus, POAH)组织中前列腺素受体EP3（E-type prostaglandin receptor EP3）表达的影响。结果金银花静脉注射后对正常新西兰兔结肠温度没有明显影响, 与生理盐水组相比, 最大体温上升高度(△T)及1 h体温反应指数(TRI1) 两组间无统计学意义(P>0.05)； IL-1β组在静脉注射IL-1β后, 结肠温度逐渐升高, △T及TRI1与生理盐水组比较,有统计学意义(P<0.01)； 而金银花+IL-1β组结肠温度上升峰值明显低于IL-1β组, 两组△T及TRI1有显著性差异(P<0.05)。新西兰兔POAH EP3在生理状态下仅有少量表达； 静脉注射IL-1β诱导实验动物发热时, EP3 表达明显增强(P<0.01)； 而金银花能减少IL-1β引起的EP3 表达(P<0.05)。结论金银花对IL-1β性发热新西兰兔的解热作用机制可能与其抑制视前区-下丘脑前部EP3 的表达有关。
       【关键词】  金银花 解热 视前区下丘脑前部 前列腺素受体EP3
       金银花是我国中医药宝库中的瑰宝,其成分复杂，含多种挥发油、绿原酸类化合物、三萜皂苷类化合物、黄酮类化合物。具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫及解热抗炎、利胆、保肝、降脂、抗生育、止血、抗溃疡等多种药理作用［1］。以金银花为主的多种复方制剂（如银翘散、银黄注射液、银黄解毒片等）对多种感染所致的发热有较好的疗效。我们以往的实验也表明［2］，金银花对IL-1β引起的发热有明显的解热作用，并用电生理方法对其中枢解热机制作了初步研究。本实验从分子生物学角度进一步探讨其中枢解热机制, 为其在临床解热中的应用提供更多的实验依据。
       1   器材与方法
       1.1  设备及试剂  ST-1型数字温度计（上海医用仪表厂）, 电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械一厂）, CM1900型恒冷箱切片机（德国徕卡公司）, DMRA2正立电动荧光显微镜（德国徕卡公司）, Leica Qwin彩色图像分析系统（德国徕卡公司）, IL-1β（美国Sigma公司）。 金银花注射液。免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。
       1.2  动物及分组  健康新西兰兔24只, 雌雄不限，体重1.5～2.0  kg， 随机分成4组，每组6只。①生理盐水(NS)对照组： 每只动物静脉注射NS 1 ml； ②金银花组： 每只动物静脉注射金银花注射液 1 ml； ③IL-1β组： 每只动物静脉注射IL-1β 100 ng（用无热原NS稀释至1 ml）；④金银花+IL-1β组： 静脉注射金银花注射液 1 ml/只, 30 min后再静脉注射IL-1β（剂量同IL-1β组）。
       1.3   发热动物模型的制备使用ST-1型数字温度计测量结肠温度。实验前3 d将兔置于实验环境中模拟操作以适应实验条件， 4～6 h/d，第4天正式实验。实验时，实验室温度保持在（23±1）℃， 将新西兰兔置于特制兔箱中， 用涂有石蜡油的测温探头经肛门插入10 cm, 并用胶布固定于尾根部，待体温稳定后, 每隔10 min记录1次结肠温度， 取3次的平均值作为基础体温。IL-1β组从耳缘静脉注射IL-1β，并每隔10 min记录体温1次， 共记录70 min； NS对照组从耳缘静脉注射NS；实验组记录体温方法相同。
       1.4   取材和切片记录至70 min时，用20%氨基甲酸乙酯进行麻醉，迅速分离双侧颈总动脉和一侧颈外静脉，其中一侧颈总动脉插管，另一侧颈总动脉结扎，开放颈外静脉，快速(2min内)输入37 ℃ 0.01 %肝素生理盐水100 ml，再先快后慢灌注4 ℃ 4%多聚甲醛200 ml，维持灌注30 min；取兔下丘脑，放入4%多聚甲醛后固定，按常规石蜡切片方法，脱水、透明、包埋、切片，厚度为4 μm，隔2取1，用作EP3免疫组化法检查。
       1.5  飘浮法免疫组化染色程序按常规ABC方法。切片脱蜡、脱水；新鲜配制的3%双氧水浸泡10 min，以消除内源性过氧化物酶；抗原修复；正常兔血清孵育30 min，滴加抗EP3抗体，4℃过夜；滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃孵育20 min；滴加试剂SABC，37℃孵育30 min；DAB显微镜下控制显色；上述各步之后均用0.01 mol/L PBS振荡漂洗3次，每次5 min；苏木素复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。阴性对照以PBS代替一抗，其余步骤相同。阳性对照采用自身对照，用PBS代替一抗和二抗作阴性对照。
       1.6  图像分析采用Leica Qwin彩色图像分析系统，每张切片随机选取10个不重叠的视野，计数每个视野阳性细胞数；每个视野随机选10个细胞，计算单个细胞面积及阳性细胞总面积来反映POAH、EP3亚型的表达水平。
       1.7  统计学分析所有实验数据均以±s表示，用SPSS11.0进行t检验。
       2  结果
       2.1  金银花对IL-1β性发热效应的影响结果见表1。从表1可以看出，金银花组和NS组新西兰兔体温没有明显变化，两组比较，△T及TRI1均无明显差异(P >0.05)；而IL-1β组与NS组相比，结肠温度升高，△T及TRI1有显著性差异(P <0.01)；金银花+IL-1β组在事先注射金银花后，温度上升峰值明显低于IL-1β组，两组△T及TRI1比较，有显著性差异(P<0.05)。
       表1  各组家兔结肠温度影响的比较（略）
       与NS组比较，*P< 0. 01；与IL-1β组比较，△P< 0.05；n=6
       2.2  金银花对发热新西兰兔视前区-下丘脑前部（POAH）前列腺素受体EP3表达的影响  结果见表2。从表2可以看出，NS对照组和金银花组视前区-下丘脑前部每个视野EP3阳性神经元个数、单位面积阳性神经元及阳性细胞面积光密度值差异无统计学意义（P> 0. 05）；IL-1β组新西兰兔POAH 每个视野EP3阳性神经元个数、单位面积阳性神经元及阳性细胞面积光密度值均明显高于生理盐水对照组（P< 0. 01）；而注射金银花注射液能抑制IL-1β诱导的EP3表达，其POAH 每个视野EP3阳性神经元个数、单位面积阳性神经元及阳性细胞面积光密度值均明显低于IL-1β组（P< 0. 05）。
       表2  各组新西兰兔POAH  EP3的表达水平（略）
       与NS组比较，* P< 0. 01；与IL-1β组比较，△P< 0.05
       3  讨论
       
       IL-1β是公认的内生致热源之一，动物实验中常用来复制发热模型。目前认为IL-1β引起发热的机制之一是IL-1β与终板血管器的血管内皮细胞及其周围的巨噬细胞、小胶质细胞胞膜上的IL-1受体结合，促进靶细胞内PGE2合成，生成的PGE2以旁分泌形式诱导下丘脑温度敏感神经元细胞膜上的PGE2受体并与之结合［3］，进而引起后续的细胞信号转导；PGE2受体有4种亚型：EP1，EP2，EP3，EP4［4］。药理学研究资料显示EP1 和EP3 可能介导了PGE2 依赖性发热；而利用基因敲除小鼠分析的结果提示EP3 更可能是PGE2 诱导发热的关键受体［5］。我们以往实验也表明［6］：IL-1β诱导发热时，视前区-下丘脑前部EP3 mRNA 的表达明显增强。PGE2与其受体结合后，通过信号转导通路改变体温调节中枢体温调定点水平［7］，从而引起机体产热和散热变化，使体温升高。如果能够下调视前区-下丘脑前部内EP3的表达，则可抑制IL-1β所致的发热。
       
       金银花具有清热解毒作用，以金银花为主的多种复方制剂对多种感染所致的发热有较好的疗效［8,9］。我们以往的实验结果也表明［2,10］，金银花有明显的解热作用，并从中枢电生理的角度阐明其解热机制与逆转致热原引起的温度敏感神经元放电频率的改变有关。
       
       本实验用免疫组化法进一步从分子水平来研究金银花的中枢解热作用机制。结果表明：IL-1β引起新西兰兔发热的同时，视前区-下丘脑前部神经元上的前列腺素受体EP3表达明显增加；而注射金银花注射液可下调IL-1β诱导的EP3表达。因此我们认为，金银花起解热作用的另一机制可能与其抑制POAH 神经元EP3的表达有关。
       【参考文献】
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