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       【摘要】 
       目的研究金黄色葡萄球菌生物膜对茶树精油的抵抗力。方法采用Brown平板改良法体外复制金黄色葡萄球菌生物膜模型，扫描电镜确认后应用载体定量杀菌实验对其进行实验研究。结果培养3 d的金黄色葡萄球菌生物膜对体积分数2.0％的茶树油耐受时间最短，作用20 min完全被杀灭；培养7 d的金黄色葡萄球菌生物膜对体积分数0.75％茶树油耐受时间最长，作用120 min才被完全清除，用金黄色葡萄球菌浮游菌滴染滤膜经体积分数2.0％茶树油处理后，均在10 min内被完全杀灭。 结论形成生物膜的细菌对茶树油的抵抗力比浮游菌强，随着生物膜形成时间延长，抵抗力明显增加。
       【关键词】  茶树油 金黄色葡萄球菌 生物膜 抵抗力
       茶树油 （Tea Tree oli）是桃金娘科（Myrtaceae）白千层属（ Melaleuca）灌木树种-互叶白千层（Melaleuca  alternifolia）的新鲜枝叶经水蒸气蒸馏得到的芳香精油。近年来，茶树油抗菌作用的研究成为国际上的研究热点，体外抗菌实验表明茶树油具有明显的广谱抗菌效应［1］，是一种具有抗菌活性的天然产物。
       
       金黄色葡萄球菌是细菌生物膜的主要形成菌，亦是静脉导管或其他医疗装置相关感染的主要致病菌，金黄色葡萄球菌生物膜一旦形成致使抗生素、化学消毒剂等均难以渗透，且易产生耐药性。研究表明，细菌生物膜（Bacterial  Biofilm， BF）是多种病原微生物常见的污染方式，如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌等，这些能形成生物膜的致病菌和条件致病菌已成为医院内感染的主要病原菌，也是医用材料发生细菌污染的重要原因。为研究金黄色葡萄球菌生物膜对茶树精油的抵抗力，采用Brown平板法［2］改良，体外复制金黄色葡萄球菌生物膜模型，并运用载体定量杀菌实验对其进行实验研究。现报道如下。
       1  器材与方法
       1.1  菌株   选择临床分离的2株金黄色葡萄球菌YB03、YB17，来源于广东省粤北人民医院住院患者静脉插管黏附菌，经本学院微生物学实验室TDR-200B全自动型微生物分析仪检测鉴定证实。按文献［3］进行生物膜定性，以确定能产生生物膜的金黄色葡萄球菌。受试菌培养采用LB肉汤，LB琼脂平板，pH 7.4 PBS等均为本实验室配制。
       1.2  药物   茶树油原液为广州奥博贸易有限公司产品，批号DA031－AU（茶树油品质符合国际化标准组织规定的茶树油中14种主要成分的组成范围ISO4730标准［4］)；取茶树油原液与吐温80各10 ml，将吐温80缓慢滴入茶树油中并振荡使其乳化成乳化液，经0.22 μm孔径滤膜滤过除菌4 ℃冰箱保存。
       1.3  试剂和仪器   TDR-200B全自动型微生物分析仪（长沙天地人生物科技有限公司）， 721分光光度计（上海第三分析仪器厂）， Olympus 光学显微镜，日立CO2 临界点干燥仪， 日立 HCP-2离子溅射仪， 日立 E-1010扫描电子显微镜（日本日立公司）。
       1.4  生物膜制备    采用Brown平板法［2］并进行改良,将复苏后传代培养16h的金黄色葡萄球菌接种于LB肉汤中37℃培养过夜，用无菌生理盐水离心洗2次，再用生理盐水重新悬浮。用分光光度计560 nm 测定其吸光度值，使菌悬液的A值达0.029（相当细菌数约为1.5×106 CFU/ml）。将此菌悬液用LB肉汤稀释10倍，注入1.5×15 cm无菌试管内5 ml，同时加入已灭菌的制备成1.0 cm×1.0 cm的一次性输液管片（已压平）， 37 ℃培养，隔2 d换1次LB肉汤连续培养7 d，即可形成成熟的金黄色葡萄球菌生物膜。
       1.5  中和剂选择实验   以金黄色葡萄球菌作为指标菌，按中华人民共和国卫生部2002版的《消毒技术规范》执行，设平行6组（分组情况见表1）进行载体定量鉴定试验。结果第6组不长菌，第1组不长菌或长菌少于第2组，第2组长菌数≥100 CFU/ml，第3，4，5组组间菌数在1.0×105～1.0×106 CFU/ml之间，组间菌量误差率≤15％，表明所选中和剂及浓度适宜。实验重复3次。
       1.6  生物膜形成的显微鉴定   从菌悬液中取出已培养3 d 和7 d的BF的载体，经无菌生理盐水冲洗去除浮游细菌，单染色，光学显微镜油镜观察可见排列紧密的葡萄球菌细菌层，弃去。取同时培养的其他BF载体膜，用pH7.2的0.1 mol/L PBS（4℃预冷）漂洗，在4℃环境中，以2.5%的戊二醛（为本实验室配制）固定4 h；用PBS漂洗3次，15 min/次；按50%，70%，90%，100%体积分数系数的乙醇梯度脱水，每梯度15 min，其中100%乙醇脱水3次；用醋酸异戊酯置换乙醇0.5 h；CO2 临界点干燥；黏台，喷金，扫描电镜（SEM）观察确认（所用试剂均为南方医科大学电镜室配制）。
       1.7  生物膜对茶树油抵抗力测定   分别将一定量的茶树油乳液加入到LB培养液内，使茶树油在培养液内的终浓度分别为体积分数2.0％，1.5％和0.75％，调pH值至7.4，分别取各5 ml置无菌三角烧瓶内，并取培养3  d和7 d的生物膜载体膜片，用无菌生理盐水冲洗去除浮游细菌，每 5 ml体积分数值的无菌三角烧瓶内放入一张膜片， 22℃水浴（不含任何药物培养基作为阳性对照），作用不同时间，取出生物膜载体，加入装有5 ml中和剂的玻璃匀浆器内，中和作用10 min，将膜片得到完全研磨，使载体表面的BF及BF内的细菌脱落，形成菌悬液，再用连续稀释法进行活菌计数，每个时间段测试3次。
       
       同时以金黄色葡萄球菌浮游菌（细菌数约为1.5×106 CFU/ml）菌悬液进行载体定量杀菌实验，作为比较。
       2  结果
       2.1  中和剂实验结果  结果表明，含卵磷脂1 g/L、硫代硫酸钠1，10 g/L吐温80的PBS作为中和剂，可有效中和茶树油对试验菌的残留作用，符合所定中和剂要求。见表1。
       表1  茶树油中和剂实验结果（略）
       2.2  扫描电镜鉴定BF的形成见图1～2。从图1可见培养3 d的金黄色葡萄球菌生物被膜细菌呈球状，隐约可见细菌之间的黏液丝借助其使部分细菌相互连接，而大部分细菌仍呈分散状为不成熟生物膜。从图2可见培养7 d的金黄色葡萄球菌生物被膜细菌数量增多，细菌之间的黏液丝将细菌相互连接形成生物膜。由于在载体样品处理过程中经脱水、干燥等步骤，因此可以推测生物膜中细菌之间在未经处理前充满了黏液。
       图1  载体在S. aureus悬液中培养3 d（不成熟BF） （扫描电镜,3 000×）（略）
       图2  载体在S. aureus悬液中培养7d（成熟BF）（扫描电镜,5 000×)（略）
       2.3  生物膜对茶树油抵抗性检测结果   实验结果表明，培养3 d的金黄色葡萄球菌生物膜对体积分数2.0％的茶树油耐受时间最短，作用20 min完全被杀灭（见表2）。培养7 d的金黄色葡萄球菌生物膜对体积分数0.75％的茶树油耐受时间最长，需要作用120 min方可达到完全杀灭的效果，见表3。
       表2  培养3 d的生物膜对不同体积分数的茶树油抵抗力测定结果（略）
       表3  培养7 d的生物膜对不同体积分数的茶树油抵抗力测定结果（略）
       实验结果显示，用金黄色葡萄球菌浮游菌滴染试验膜经体积分数2.0％的茶树油处理后，在10 min内被完全杀灭，无残留存活菌，证实生物膜细菌对茶树油的抵抗力明显大于浮游菌。
       3  讨论
       
       细菌生物膜是细菌细胞及其产生的细胞外大分子多聚物所形成的一种特殊细菌群落，是高度组织化的多细胞结构。自然界中和人体内外的绝大多数细菌并非是浮游生长的个体生物，而是附着在有生命或无生命物体的表面，以生物膜方式生长［5］。生物膜对于抗菌药物和消毒剂具有天然的抵抗力，是造成顽固性感染和医院内感染的主要原因。据估计，人类60％ 的细菌性感染与生物膜有关［5］。然而，直至20世纪70年代，人们才观察到生物膜的存在，并最终认识到生物膜才是细菌自然的和首选的栖息方式。
       
       本实验采用模拟生物医药材料（一次性输液管）体外制备细菌生物膜。实验结果显示受试菌可吸附于一次性输液管载体片上，经3 d和7 d的孵育，可在载体上形成不成熟和成熟的BF（见图1～2），从电镜照片上可见金黄色葡萄球菌生物膜的形成是由细菌分泌的多糖粘质的粘附作用而实现的，与文献［6］报道相符。
       
       本次实验显示，培养3 d的金黄色葡萄球菌生物膜对体积分数2.0％的茶树油耐受时间最短，作用20 min被完全清除杀灭（见表2）。培养7 d的金黄色葡萄球菌生物膜对体积分数2.0％的茶树油耐受时间60 min被完全清除杀灭，对0.75％的茶树油耐受时间最长，需要作用120 min方可达到完全杀灭的效果（表3）。结果显示，培养3 d的金黄色葡萄球菌BF对体积分数为2.0％，1.5％，0.75％茶树油的抵抗力弱于培养7 d的金黄色葡萄球菌BF（见表1～2），说明成熟的BF对茶树油的抵抗力更强，可能与金黄色葡萄球菌的Agr(accessory gene regulator)密度感应系统有关，其密度感应系统彼此协同，调整群体生存的密度共同应对外界环境的异常变化产生抵抗力，而不成熟的BF，密度感应系统活化受限［7］。
       
       本实验结果显示茶树油对BF有明显的抗菌活性，用金黄色葡萄球菌浮游菌滴染试验膜经体积分数2.0％的茶树油处理后，在10 min内被完全杀灭，对金黄色葡萄球菌生物膜的清除作用亦呈明显的浓度依赖性。目前茶树油杀菌机理的研究尚处于起步阶段，脂质体研究［8］表明茶树油主要抗菌成分萜烯－4－醇具有破坏和穿透脂结构的能力。茶树油作为天然产物是100多种组分的混合物，由于植株的生长条件不同，组分具有不均匀性，不同生产批次的茶树精油组分可能存在较大的差异［9］。综上所述，茶树油对金黄色葡萄球菌生物膜呈现明显的清除杀菌作用，具备良好的应用前景。
       
       致谢：南方医科大学电子显微镜室安连兵老师提供的电镜技术支持。
       【参考文献】
         　　［1］ Carson C F, Riley T V. Antimicrobial activity of the major components of essential oil of melalerca alternifolia［J］.J Appl Bacteriol,1995, 78(3)：264.
       
       ［2］ Anderl JN,Zahller J,Roe F,et al. Role of nutrient limitation and stationary－phase existence in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to Ampicillin and Ciprofloxacin［J］.Antimicrob Agents Chemother,2003,47(4)：1251.
       
       ［3］ Arcioia CR , Baldassarri L, Monianaro L . Presence of ica A and ica D genes and slime production in a collection of staphylococcal strains from catheter associated infactions［J］.J Clin Microbiol, 2001,39：2151.
       
       ［4］ International organisation for standardisation. Essential oils-oil of Melaleuca, terpinen-4-ol type (tea tree oil). ISO-4730［S］.Geneva, Switzerland: international organisation for standardisation,1996.
       
       ［5］ Tunney MM, Ramage G, Field TR, Moriarty TF, Storey DG. Rapid Colorimetric Assay for Antimicrobial Susceptibility Testing of Pseudomonas aeruginosa［J］.Antimicrob Agents Chemother,2004,48（5）：1879.
       
       ［6］ Donlan R M. Biofilms: Microbial life on surfaces［J］.Emerging infections Disease. 2002,8(9)：881.
       
       ［7］ Mack D,Rohde H, Dobinsky S, et al . Identification of three essential regulatory gene loci governing expression of Staphylococcus epidermidis poiysaccharide intercellular adhesin and Biofilm formation［J］.Infect Immun.,2000,68(7)：3799.
       
       ［8］ Sikkema J, Debont J A M, Poolman B. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons［J］.Microbiol Reu, 1995,59(2)：201.
       
       ［9］ Brophy J J,Davies N W. Southwell I A,et al. Gas chromatographic quality control for oil of Melaleuca terpinen-4-ol type (Australian tea tree)［J］.J Agric Food Chem,1989,37：1330.