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       【摘要】 
       目的分析王不留行中具有抑制血管生成的活性成分。方法 分别在体外培养人微血管内皮细胞(HMEC)和体内鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型的实验指导下，从王不留行中分离得到两种成分，用化学与光谱分析法鉴定其化学结构。结果这两种活性成分分别为王不留行环肽A，E。结论王不留行中抑制血管生成的活性成分是王不留行环肽A，E。
       【关键词】  王不留行 环肽 王不留行环肽A，E 血管生成
       王不留行系石竹科麦蓝菜Vaccaria segetalis(Neck) Garcke 的干燥成熟种子, 为传统常用中药,有行血通经, 催生下乳, 消肿敛疮等功效。其植物资源丰富, 除华南外, 全国各地均有分布, 尤以河北产量最大［1］，据报道其含有生物碱、黄酮、皂苷及环肽类等成分。本文在抑制HMEC增殖活性实验和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验的指导下，对王不留行进行了系统地提取分离，最终得到两种活性较高的成分，结构鉴定为王不留行环肽A、E。首次发现王不留行中环肽A，E具有抑制血管生成的作用。　
       1  器材
       1.1  材料与仪器AKTA explorer 100液相系统(Amersham公司)；SRB ( Sigma公司)；MCDB-131细胞培养基(Gibco BRL 公司)；胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺(华美生物工程公司) ；WATERS Platform ZMD 4000型液质联用仪(Waters公司)；富立叶变换红外光谱仪；Model 3110 细胞培养箱(Thermo-Forma公司)；MK3型酶标仪( Thermo-Lab-Systems公司) ；王不留行药材购自江苏省无锡市山禾药业股份有限公司，南京中医药大学陈建伟教授鉴定为Vaccaria segetalis (Neck) Garcke。受精黄皮种蛋购自无锡马山种鸡场。
       1.2  细胞株人微血管内皮细胞(HMEC)由法国国家卫生医药研究院U553研究所(INSERM U553) 陆核教授馈赠，保存于液氮罐中。
       2  方法
       2.1  样品提取与分离在体外抑制HMEC增殖活性实验指导下，按以下步骤进行分析：将5 kg王不留行水煎煮两次，提取液静置，离心，去沉淀，上清液经D-101型大孔树脂柱，依次以水，30%乙醇，50%乙醇，75%乙醇洗脱。收集75%乙醇洗脱液，回收浓缩至无乙醇味，再用正丁醇萃取，取正丁醇萃取物经反相Resource柱分离，CH3CN梯度洗脱得到组分A（16.8 mg, tR＝35 min)和组分B（24 mg, tR＝42 min)。
       2.2  细胞培养　将HMEC用含1 mmol/L谷氨酰胺、1 mg/L氢化可的松、10 μg/L EGF和150 ml/L 小牛血清的MCDB-131培养液, 于37℃，50 ml/L CO2培养箱中传代培养。
       2.3  SRB实验 参照Skehan等［2］报道的SRB方法测定组分A、B对HMEC增殖的抑制率。取对数生长期细胞，按每孔7 000～8 000个细胞接种于96孔板中放置于37℃，50 ml/L CO2 的培养箱中培养过夜，加入不同浓度的组分A、B ，以不加药组为阴性对照培养72 h。去上清液, 每孔轻轻加入100 g/L三氯醋酸100 μl固定, 静置5 min后移到4℃再放置1 h倒掉固定液, 用去离子水洗5次, 空气干燥。每孔加入4 g/L SRB 100 μl室温放置30 min，用10 ml/L醋酸液洗5次，加入150 μl 10 mmol/L Tris碱液(pH 10. 5)溶解，用MK3型酶标仪在波长A570处测定每孔A 值。计算抑制率(% )同时绘制药物浓度抑制率曲线, 求出半数细胞抑制浓度( IC50) 。抑制率（%）= ［(对照组的A值- 药物组的A 值) / (对照组的A值- 空白组的A值) ］  ×100%。
       2.4  CAM血管生成实验受精黄皮种蛋，参考文献方法［3］制备鸡胚尿囊膜。用打孔器制备直径为6 mm的微孔滤膜圆片，湿热高压消毒。设组分A、B给药组和生理盐水阴性对照组。将药物滴于滤纸上，制成药膜，吹干备用。鸡胚培养3 d后分组，将药膜贴于CAM的部位。加药48 h后，观察药膜周围的血管数，并摄影记录。
       2.5  组分A、B的液质联用分析
       2.5.1  液相色谱条件色谱仪：WATERS 2690；检测器：WATERS 996；分析柱：SUNFIRE C18( 2.1 mm×150 mm)；流动相：甲醇∶水，65%甲醇洗脱；柱温：35℃；流速：0.5 ml/min；进样量：5 μl。
       2.5.2  质谱分析条件离子方式：EIS；毛细管电压：3.88 KVolts；锥孔电压：15 Volts；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：300℃；质量范围：200～1 000 m /z；光电倍增器电压：700 Volts； Analyser Vacuum：2.6e-5 mBar； Gas Flow：4.2 lit/h。
       2.6  组分A，B的红外光谱分析采用KBr压片法。
       2.7  组分A，B的氨基酸分析  按照GB/T18246-2000的方法分析。
       3  结果
       3.1  活性鉴定
       3.1.1  SRB法测定组分A，B对HMEC增殖的影响结果显示组分A和组分B均有抑制HMEC体外增殖的活性，IC50分别为25，7 μg/ml，且其活性具有剂量依赖关系。结果见图1。
       图1  组分A，B对HMEC-1体外增殖的抑制作用（略）
       3.1.2  组分A，B抑制CAM新生血管的形成CAM血管抑制试验是一种被广泛应用的体内血管抑制模型。本实验发现生理盐水阴性对照组CAM血管生成非常明显，血管在药膜下呈放射状生长，血管粗大，血液充盈血管分支较多，毛细血管密度大。组分A，B则明显抑制了血管生成，放射状生长的血管数目大为减少，血管主要以零星、杂乱、叶脉样等表现形式存在，血管细小，稀疏，血管分支少，在药膜片下及周围局部鲜有血管区，或者血管断裂或消失，结果如图2所示。
       图2  组分A，B对CAM 新生血管生成的影响(10×)（略）
       3.2  结构鉴定
       3.2.1  组分A白色粉末状，可溶于甲醇，难溶于水。分子式为C31H43O6N7 ，ESI- MS  m/z  610［M + H ］+ ， 511,414,315, 258 IR（KBr）cm-1 3 332, 3 234, 1 656, 1 631。氨基酸水解含有甘氨酸、酪氨酸、颉氨酸、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸。以上数据与文献［4，5］报道一致，故组分A鉴定为：segetalin A。
       3.2.2  组分B  白色结晶状，可溶于甲醇，难溶于水。分子式为C43H56O8N8，ESI- MS m/z 813［M + H ］+ ，683，514，417，318。IR（KBr）cm-1  3 307，2 956，1 632，1 516，1 448，1 236，744 。氨基酸水解含有甘氨酸、酪氨酸、颉氨酸、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸。以上数据与文献［4，5］报道一致, 组分B鉴定为segetalin E，结构见图3。
       图3  组分A，B结构图（略）
       4  讨论
       
       血管生成(angiogenesis)指的是组织利用既存血管产生新的血管的过程。正常生理情况下，仅发生于创伤修复或月经周期的卵巢和子宫内膜，但许多疾病如肿瘤，可出现持续的、不可控制的血管生成。新血管生成是癌肿生长和扩散的必要条件，抗血管生成可能是限制肿瘤生长和防止转移的良策。利用血管生成抑制剂特异性地抑制血管内皮细胞的增生和鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的活性，可抑制肿瘤的生长和转移，开展抑制肿瘤血管的药物筛选研究是抗肿瘤研究的热点。
       
       目前国内外临床不乏有效的抗血管生成药物, 但大多有效药物在抑制血管生成的同时存在不可抵抗的副作用, 如出/凝血异常、加重心血管疾病、影响成年妇女卵泡发育和正常的月经周期等［6］，因而限制了其临床应用。鉴于天然药物毒副作用小, 人们开始从天然药物中寻找有效的血管生成抑制剂。
       
       本实验中以血管内皮细胞SRB实验和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验为模型，从中药中筛选得到王不留行水提取具有较强抑制血管生成的作用，进而采用树脂吸附、萃取、反相中压层析等手段对王不留行进行系统提取分离纯化，得到王不留行环肽A,E ,二者均有较强的抑制HMEC增殖和鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成的生物活性，其中环肽E的作用强于环肽A，这是以往文献未见报道的。因此可以将王不留行环肽A,E作为血管生成抑制剂的药用先导化合物来研究，具有临床开发利用的价值。
       【参考文献】
         　　［1］ 江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海人民出版社，1997：311.
       
       ［2］ Skehan P, Storeng R, Scudiero D, et al. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening［J］.J Natl Cancer Inst, 1990, 82 (13)：1107 .
       
       ［3］ 张树成，吴志奎，王 蕾，等. 研究中药血管生成活性和作用的鸡胚绒毛尿囊膜试验模型的应用［J］.中国中医基础医学杂志，1999，5(5)：16.
       
       ［4］ Morita H, Yun S K, Takeya K, et al. A cyclic heptapeptide from vaccaria Stgetalis, 1996,42：439.
       
       ［5］ Morita H, Ynu S K, Itokawa H, et al. Confor mational analysis of a cyclic Hexapeptide, Segetalin A from Vactaria Segetalis 1995,51(21)：5987.
       
       ［6］ Epstein SE, Kornowski R, Fuchs S, et al. Angiogenesis therapy: amidst the hype, the neglected potential for serious side effects［J］.Circulation, 2001, 104(1)：115.