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       【摘要】 
       目的评价蒲葵子抗癌有效部位是否有致突变性。方法在药效实验跟踪下，从蒲葵子中提取分离抗癌有效成分；采用小鼠微核试验方法对其进行诱变性检测。结果在给予剂量为11，5.5，2.75，1.375 g/kg（相当于成人日用量845倍，422倍，211倍，105倍）时，各组均未出现骨髓细胞微核率增加。结论在该实验条件下，未发现蒲葵子抗癌有效部位提取物的诱变性。
       【关键词】  蒲葵子 抗癌有效部位 诱变性 微核实验
       Micronucleus Experiment on the Extracts of the Seeds of Livistona chinensis in Mice
        ZHONG Zhenguo1，  LUO Pei1，HUANG  Yan1，PAN Lina1，HUANG Jinlan1，LI Peng1，ZHAO Shiyuan2，LIAO Wen1, WEI Xiaoqing1
        (1.Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning, Guangxi 530001,China; 2.The Nationality Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning, Guangxi 530001, China)
        Abstract：ObjectiveTo evaluate the mutagen city of extracts of the seeds of Livistona chinensis. MethodsHeat circumfluence extraction was adopted to withdraw and isolate Livistona chinensis active principle. The micronucleus tests in mice were carried out. ResultsThe micronucleus rates in the dose of 11，5.5,2.75,1.375 g/kg were not significantly different from the control group.ConclusionNo mutagen city effects of the the extracts of the seeds of Livistona chinensis were detected in this study.
        Key words：Livistona chinensis；  The extracts of anticancer；  Mutagen city effects；  Micronucleus test
        蒲葵Livistona chinensis R.Br为棕榈科植物。文献报道及我们的前期研究结果表明，蒲葵子具有抗肿瘤作用［1，2］。在前期研究工作中，尽管我们没有发现蒲葵子的抗癌有效部位具有急性毒性作用，但为确保蒲葵子抗癌有效部位提取物临床用药的安全性，有必要对其进行深入的临床前安全性评价。作为课题项目的一部分研究内容，本实验采用小鼠微核实验研究其诱变性。
       1  材料
        1.1  受试药物 蒲葵子抗癌有效部位提取物：在抗癌药效实验跟踪下，采用乙醇回流提取及醋酸乙酯反复浸提从蒲葵子中筛选得到抗癌有效部位(以下简蒲葵子提取物)。
        1.2  阳性对照物 环磷酰胺（CTX），江苏恒瑞医药股份有限公司，产品批号：07042621。
        1.3  动物 昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重25～30 g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK2003-0003。
        1.4  试剂 小牛血清（56℃恒温水浴保温1 h,灭活后储存于4℃冰箱备用）。吉姆萨(Giemsa)应用液(临用前用pH＝6.8的磷酸盐缓冲液与吉姆萨储备液以9∶1混合而成。)
       2  方法［3～8］
        2.1  动物分组及给药方法 将雌雄各半的60只小鼠分为两大组，每组30只，然后将每大组30只小鼠随机分为6个小组，每小组5只，其中试药组4组（即试药Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ组，分别予蒲葵子提取物11，5.5，2.75，1.38 g/kg体重）、阴性对照组及阳性对照组，实验组给予蒲葵子提取物，阳性对照组给予环磷酰胺40 mg/kg体重，空白对照组为纯净水。经口灌胃给药，给药组和阴性对照组每天给药1次,连续给药4 d，第5天取样；阳性对照组为第4天腹腔注射环磷酰胺1次，给药后24 h取样。
        2.2  标本制作颈椎脱臼处死小鼠，取股骨，剔净肌肉，剪去两侧股骨头，暴露骨髓腔，用注射器吸取少量小牛血清冲洗骨髓至玻片上，轻轻混匀，推片。待涂片自然晾干后，放入甲醇液中固定10 min，晾干。用Giemsa应用液染色10～15 min，用蒸馏水冲掉玻片上的染色液，晾干。
        2.3  结果观察及判断选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域，在油镜下观察嗜多染红细胞（PCE）的微核。镜下嗜多染红细胞呈灰蓝色，成熟红细胞呈粉红色。典型的微核多为单个的、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色，直径通常为红细胞的1/20～1/5。采用双盲法阅片，每只动物计数1 000个嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率用千分率表示。1个PCE中出现有2个或多个微核，仍按1个计数。每只动物至少记数200个PCE，同时计数所见到的NCE（成熟红细胞）数。计算PCE/NCE的比值。
        微核率（‰）＝含微核细胞数÷观察细胞数×1000‰
        2.4  数据处理方法所得数据均采用SPSS11. 5进行分析处理，计算各组算术均数和标准差。用χ2检验微核发生率的各组间差异。PCE/NCE的比值用单因素方差进行分析。
       3  结果
        各组小鼠骨髓微核检测结果见表1。表1  小鼠骨髓嗜多染红细胞微核检测
        各剂量组与阳性对照组相比，*P<0.001；各剂量组与阴性对照组相比，P>0.05；n=5（PCE：嗜多染红细胞；NCE：成熟红细胞）
        微核率计数结果显示，雌、雄蒲葵子提取物各剂量组与阴性对照组相比，无显著性差异（P>0.05）；与阳性对照组相比，有显著性差异（P<0.001），显示阳性对照药可增加微核率；蒲葵子提取物试药组的微核细胞数与剂量无关，表明蒲葵子提取物对小鼠骨髓细胞无致突变作用。嗜多染红细胞/成熟红细胞，雌、雄蒲葵子提取物各剂量组、阳性对照组与阴性对照组相比均无显著性差异（P>0.05），并且未明显超出正常范围（0.6～1.2）。该受试物小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验为阴性。
        4  讨论
        微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒断片或环。在末期以后，它单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内，由于它比核小得多故称微核。微核试验从建立伊始就因其灵敏、稳定，且能检测染色体完整性改变和染色体分离改变两种遗传学终点而得到广泛应用，随分子生物学技术的发展，现已成为可检测多终点的分子毒理学方法，也是目前国际上公认的筛选致突变物的一种主要方法。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验作为一种检测染色体损伤(包括染色体完整性改变和染色体分离两种遗传学终点)的哺乳动物真核细胞体内试验与Ames试验配合能准确反映受试物的遗传毒理学作用。
        小鼠骨髓微核试验的优点是快速、简便、不需要特殊试剂及设备；不要求有良好的核型，终点易于辨认，不需要高深的遗传学知识，而且微核的自发率低，种间差异小。但是其和染色体畸变试验比能检测的染色体畸变类型较少，一些畸变类型微核试验不能检出。另外作用于特定细胞、组织的诱变剂，在骨髓内不一定能达到引起染色体畸变和纺锤体损伤的浓度，或细胞毒作用太强、抑制细胞分裂或只引起点突变的化学物质，微核试验均呈阴性。由于以上的局限，目前此方法对己知致癌剂的检出率仅65%～75%。随着技术方法的不断进步，除此之外还发展许多不同类型微核试验，例如胚胎转移微核试验，哺乳动物减数分裂细胞微核试验，肝细胞微核试验，体外微核试验，外周血微核试验等。
        本实验采用了Heddle 1984年推荐的方案进行染毒［7］，它的优点在于仅取样一次就能覆盖24～72 h的高峰 即使高峰在96 h也不会漏去，同时又做到了多次染毒。
        蒲葵子提取物的雌、雄各剂量组微核率与阳性对照组(环磷酰胺)相比，差异有显著性(P<0. 01)，与阴性对照组相比，差异无显著性(P>0. 05) ，且无剂量-效应关系。雌、雄各给药组、阳性对照组与阴性对照组相比，PCE/NCE的比值均无显著性差异，P>0.05，可见对小鼠骨髓细胞增殖未产生抑制，试验结果可信。因此蒲葵子提取物的微核试验结果为阴性，不具有对小鼠骨髓细胞染色体的断裂效应及纺锤体毒效应。
       【参考文献】
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       ［2］ 钟振国，张凤芬，张雯艳，等.蒲葵根提取物的体外抗肿瘤实验研究［J］.中药材，2007，30（1）：60.
       
       ［3］ 陈书明，聂向庭.鹿茸醇提物对用环磷酞胺处理的小白鼠红细胞免疫功能的影响［J］.经济动物学报，2000，4(1)：23.
       
       ［4］ 陈少华，洪振丰，罗仁夏，等. 茵陈蒿拮抗AFB-1诱发基因突变和小鼠骨髓细胞遗传损伤的实验研究［J］.癌变 畸变 突变，1998，1（1）：35.
       
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