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       【摘要】 
       目的研究调脾护心方的清除自由基活性及其成分。方法分别采用乙醇或水加热提取调脾护心方成分，并用石油醚、氯仿、醋酸乙酯和正丁醇依次进行萃取，利用1，1-二苯基-2-2苦基肼基游离法（DPPH法）进行清除自由基活性实验，同时与合成抗氧化剂维生素C进行对照。结果各组分均有一定的清除自由基作用，且调脾护心方水提物的醋酸乙酯萃取部分具有最高的清除自由基活性。结论 调脾护心方中的多酚类成分是主要的抗氧化活性成分，值得进一步研究。
       【关键词】  调脾护心方 清除自由基活性 1，1-二苯基-2-2苦基肼基
       Antiradical Effect of Regulating Spleen and Nourishing Heart Formula and its Fractions by DPPH Assay
        ZHU Wei ,RUAN Xinmin*
        (Heart Center of Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510106，China)
        Abstract：ObjectiveTo investigate the free radical scavenging activities and principals of regulating spleen and nourishing heart formula.MethodsThe water-extracted and  regulating spleen and nourishing heart formula were separated by the order of ligarine, chloroform, ethyl acetate, and n-butano1. The antioxidant activity of regulating spleen and nourishing heart formula and its fractions were investigated by 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) assay. ResultsAmong them, the ethyl acetate fraction of water extract had the most potent antioxidative effect.ConclusionThe polyphenols from regulating spleen and nourishing heart formula are main antioxidative compounds and worthy of  further research.
        Key words：Regulating spleen and nourishing heart formula；  Free radical scavenging activity；  DPPH
        人体在利用氧的过程中，会因各种内源性或外源性因素而产生活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）及各种自由基如氮自由基（NO）。如果自由基产生过多或清除过少，过量的自由基就会攻击生物大分子，导致细胞结构和功能破坏。因此自由基是人类衰老和许多疾病如肿瘤、心脑血管病等的重要诱因。寻找能够有效清除自由基而无毒副作用的抗氧化剂，预防和减轻上述疾病的发生和发展，是研究的重要课题之一。调脾护心方（由生黄芪、三七、茯苓、橘红等药组成）近年来在广东省中医院心脏中心被广泛用于治疗冠脉搭桥围手术期患者，临床疗效十分显著，能降低术后再狭窄的发生率，显著提高患者的生活质量，值得进一步深入研究［1～12］。本实验利用1，1-二苯基-2-2-苦基肼基游离基法（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl， DPPH法）测定调脾护心方及其不同组分清除自由基的能力，为调脾护心方的临床疗效提供一定的理论依据。
       1  器材与方法
        1.1  仪器与试药DPPH、维生素C(Vit C)为美国SIGMA公司产品，其它试剂均为国产分析纯。UV2100型紫外-可见分光光度计［UNICO（上海）仪器有限公司］；瑞士梅特勒－托利多公司AE-200型万分之一电子分析天平。
        1.2  药品与试剂中药饮片黄芪为豆科植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf 的干燥菌核，橘红为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco的干燥外层果皮，三七为五加科植物三七Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen 的干燥根。以上中药饮片均于统一购自广东康美，以上中药饮片经广东省中医院中药制剂学实验室丘小惠研究员鉴定符合《中国药典》2000版标准，样品凭证标本存于广东省中医院心脏中心中药标本室。
        1.3  DPPH溶液的配制精确称取DPPH 19.7 mg，加少量无水乙醇溶解，用250 ml容量瓶，加入95%乙醇定容， 配制250 ml浓度为0.2 mmol/L的DPPH 溶液，待用。
       2  方法
        2.1  提取分离将组成汤各单味药供试饮片粉碎，45℃恒温干燥2 h，置干燥器中存放5 d。称取干燥护心方粉末1 kg，室温下分别用纯水或80%乙醇加热提取，过滤，滤渣同上重复提取两次，合并滤液，减压旋转蒸发溶剂，得粗提物。将所得粗提物分散于水中，依次用石油醚、醋酸乙酯、氯仿和正丁醇萃取，每种溶剂萃取3次。合并萃取液，置于圆底烧瓶中，旋转蒸发去除溶剂，分别得石油醚萃取物、醋酸乙酯萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物、水残留物。
        2.2  DPPH法测定DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能将其清除，则提示受试物有降低羟自由基（-OH）、烷自由基（R-）或过氧自由基（-O2）和打断脂质过氧化链反应的作用。DPPH实际上是以自由基DPPH-的形式存在的，所以，它有个单电子，在571 nm波长处有强吸收，其乙醇水溶液呈很深的蓝紫色，在加入受试物后，在571 nm波长处可以动态监测DPPH被清除的效果，这种效果通常用对DPPH的抑制率来表示。显然，抑制率越大，DPPH自由基清除越彻底，受试物的抗氧化性越强。分别准确量取将一定浓度的待测样品对半稀释的0.1 ml加入5支10 ml比色管中，各加入浓度为0.6 mmol·L-1DPPH溶液3.5 ml，用蒸馏水定容至5 ml，室温下静置反应30 min后，在517 nm处测定吸光度，因体系内DPPH自由基的浓度与其吸光度成正比， 所以可以直接以下式计算对DPPH自由基的清除率［13］。清除率(%)=(A0- A) /A0×100 %。
        式中：A0为未加样品时测定的DPPH的吸光度；A为加入样品后测定的DPPH的吸光度。
       3  结果
        3.1  各萃取组分的得率比较两种不同提取方法得到的萃取组分可以得知，调脾护心方醋酸乙酯萃取组分在水提物中所占的比率约为醇提物的两倍（表1），可推测多酚类物质在水提物的醋酸乙酯萃取组分中含量较多；氯仿萃取组分在两类提取物中占的比率很大，我们推测其可能为植物色素类物质；剩余水相是一类很复杂的物质，可能包括游离单糖，氨基酸及其他一些未知成分等。表1  各萃取组分得率
        3.2  各萃取组分的抗氧化能力调脾护心方的各萃取组分具有一定的抗氧化作用（见表2），其中水提物的醋酸乙酯萃取组分清除自由基的能力最强。表2  调脾护心方不同萃取提取组分抗氧化能力的比较
       4  讨论
        近年来的研究证实，人体内自由基增多导致的脂质过氧化作用与多种疾病有关，因此，对抗氧化药物的研究已成为自由基医学研究领域中的一个重要课题。　开发和研制天然植物抗氧化剂，消除氧自由基对机体的损害作用，是目前医药和食品研究中的一个重点。本研究发现调脾护心方的各萃取组分都具有一定的抗氧化作用，这可能是调脾护心方发挥临床疗效的机制之一。其中调脾护心方水提物的醋酸乙酯萃取组分清除自由基的能力最强，说明方中所含的多酚类物质是抗氧化的主要成分。有流行病学研究发现，欧美等发达国家的心脑血管发病率和死亡率都居世界首位，而法国却与此相反［14］。调查发现，法国红葡萄酒消费量居世界首位，红葡萄酒中含有大量多酚类物质—原花青素，它们可以有效地清除有害的氧自由基，抑制红细胞膜和低密度脂蛋白脂质过氧化，促进内皮细胞松驰因子的形成，防止血小板凝聚，防止心脑血管疾病［15～17］。多酚类化合物广泛分布于植物次生代谢产物中，具有较强的清除自由基和抗氧化的能力［18］，因此需要针对调脾护心方中的多酚类成分进行更深入的研究。
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