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       【摘要】 
       目的观察推拿加功能训练对膝骨关节炎家兔模型关节液中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）的影响，探讨推拿加功能训练治疗膝骨关节炎的机制。方法将新西兰大白兔40只随机分为空白对照组(A组)、模型对照组(B组)、电针治疗组(C组)、推拿加功能训练治疗组（D组）。除A组外，B，C，D组动物造模。造模后，A组和B组正常饲养,不处理；C组给予电针治疗；D组采用手法加功能训练治疗，连续治疗21 d。结果推拿加功能训练和电针治疗组连续治疗3周，均可以显著降低关节液中MDA和NO的含量，升高SOD的活性，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05)；推拿加功能训练组处理前后比较有显著性差异(P<0.05)。结论推拿加功能训练和电针治疗可通过降低膝骨关节炎关节液中MDA和NO的含量，升高SOD活性，抑制了膝骨关节炎中过多的自由基对软骨细胞的破坏，提高了氧自由基的清除能力，从而发挥对骨关节炎的防治作用。
       【关键词】  膝骨关节炎 推拿加功能训练 自由基
       Effects of Massage on Free Radical in the Rabbit Model with Joint Liquid of Knee Osteoarthritis
        HUANG Jian,ZHUO Lianshi,WANG Yongyu
        (College of Traditional Chinese Medicine of Chongqing Medical University,401331,China)
        Abstract：ObjectiveTo observe the effects of  massage on synovia SOD，MDA and NO contents in rabbits with Knee Osteoarthritis(KOA)．MethodsA total of 40 New Zealand rabbits were randomly divided into the control, model, electroacupunctur(EA) groups and massage one. KOA model was established by gypusum fixing method.  For massage group ,the affected knee joint was pressed , kneaded, stretched and rotated repeatedly for 15 min every time, followed by forced running about 100 m. The intra-joint synovia was collected (0.4～0.6 ml) for detecting the contents of SOD,MOA and NO with radioimmunoassay．ResultsAfter massage was given for 3 weeks，the contents of MDA and NO  were lowered maarkedly,while the level of SOD was increased．Compared with the control group, there was significant difference(P<0.05). ConclusionThe massage has preventive and curative effects on Osteoarthritis by lowering MDA and NO, and increasing SOD in the Knee Joint Liquid．
        Key words：Knee Osteoarthritis；  Massage；  Free radical
        膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)主要病变为膝关节软骨退行性变和继发性骨质增生,是临床中常见的关节疾病，好发于中老年人。近年来,临床上不断有报道针灸、推拿加功能训练及针刀等方法治疗膝骨关节炎取得较好疗效［1］。许多研究表明，自由基参与骨关节炎的发生和发展，为其重要病因之一。本实验观察推拿加功能训练对膝骨关节炎家兔模型关节液中自由基（SOD，MDA和NO）含量的变化,旨在证实推拿加功能训练治疗膝骨关节炎的疗效，探讨膝骨关节炎的发病机理以及推拿加功能训练治疗骨关节炎的机理。
       1  材料与方法
        1.1  动物  健康新西兰大白兔40只(从重庆医科大学动物中心购买)，雌雄各半，雌无孕，体重2.0～2.5 kg。随机分为空白对照组（A）、模型组（B）、电针治疗组（C）和推拿加功能训练治疗组（D），每组10只。B，C，D组造模成功后，C，D两组每只每日分别给予电针或推拿加功能训练治疗1次。
        1.2  药品及试剂   SOD，MDA和NO试剂盒（从南京建成生物工程研究所购买）。离心机(中佳公司,KDC-2046型，3 500～4 000 r/min，离心10 min)和推拿加功能训练仪(广东省汕头市医用设备厂, 6805-β)等。
        1.3  动物模型  实验动物同等条件下稳定饲养7 d后，B，C，D组按照膝关节石膏制动法造模。先剪去所有动物左后肢踝关节以上的兔毛，用管型石膏将其左后肢伸直位固定，石膏外以透明胶纸封好，以防兔撕咬，若石膏松动或脱落者及时重新固定［2］。
        1.4  组织学检查分别于造模成功后和治疗结束后随机从B，C，D各组中抽出一只家兔处死，处死后立即切取家兔胫骨平台内侧关节面的完整软骨及软骨下骨组织标本，用10％的甲醛溶液固定48 h，脱钙2～3 d，石蜡纵向包埋固定，常规切片，HE染色。观察滑膜与软骨的病理变化［3］。
        1.5  关节液中SOD，MDA和NO的测定分别于造模成功后和治疗结束后，采集A，B，C，D 4组动物的关节液，获得4组动物膝关节冲洗液，回收量0.4～0.6 ml，平均0.5 ml，经离心后,取上清液于-20℃低温冰箱中保存待测。具体方法：施行膝关节穿刺，证实刺入关节腔后，注入0.9%的生理盐水0.5 ml，反复回抽、注入3次后，再尽量抽出腔内液体。抽取关节液后，每只兔肌注2万u庆大霉素，以防膝关节感染［4］。采集标本后,用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定SOD活力，硫代巴比妥(TBA)法在532 nm波长处测定吸光度以测定MDA，用硝酸还原酶法测定NO，操作分别按试剂盒说明书进行。
        1.6  针刺方法  C组于造模成功后，参照《实验针灸学》［5］与《动物针灸学》［6］取“血海、梁丘、阳陵泉和足三里4个穴位”，以30号、1寸毫针针刺， 直刺或斜刺20～30 mm，得气后，针柄接电针仪治疗，每次留针25 min，1次/d，连续治疗21 d。正常组、模型组正常饲养。推拿加功能训练治疗组(D组)：每天用按摩、揉捏、点压、分筋、理筋等手法以松解股四头肌，顺逆时针旋揉髌骨，再作内旋内收、外展外旋、屈伸髋和膝关节各5次，15 min/次，最后平地赶跑100 m。
        1.7  图像分析 将各组中动物的病理切片，放在光学显微镜下进行图像分析。观察软骨和滑膜的病理改变。
        1.8  统计学处理方法所有实验数据用SAS10.0以上软件进行分析,以±s表示,组间差异采用方差分析(ANOVA)中的SNK法，各组治疗前后差异采用t检验，以P<0.05作为显著性差异的标准。
       2  结果
        2.1  病理切片观察造模后随机从各组中取出一只动物处死,解剖A组动物,肉眼观察膝关节面光滑呈淡蓝色；B，C，D组动物关节软骨面粗糙呈黄色，边缘骨质破坏，有骨赘增生。病理切片采用HE染色，观察发现A组动物关节滑膜无增厚，软骨细胞排列均匀，无增生，软骨边缘光滑；B，C，D组关节滑膜增厚，有炎性细胞浸润，软骨细胞排列不均，边缘破坏，粗糙不平，有软骨细胞增生。见图1～2。
        2.2  处理前后各组关节液中SOD，MDA和NO含量的测定结果见表1～3。表1  治疗前后各组关节液中SOD的活性比较 从表1可以看出，造模后B，C，D组关节液中SOD的活性均呈较低，与A组比较有显著性差异(P<0.05)。C，D组处理前后有显著性差异(P<0.05)。A，B组处理前后比较无显著性差异(P>0.05)。治疗后D组关节液中SOD的活性升高，与B组比较有显著性差异(P<0.05)，说明推拿加功能训练治疗能升高骨关节炎关节液自由基SOD的活性，提高了氧自由基的清除能力，抑制氧自由基对软骨细胞的破坏，从而起到防治膝骨关节炎的作用。表2  治疗前后各组关节液中MDA的含量比较表3  治疗前后各组关节液中NO的含量比较与空白对照组比较，☆P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05；与治疗前后比较，#P<0.05；n=9
        从表2～3可以看出，造模后,B，C，D组动物关节液中MDA和NO的含量明显升高，与A组比较有显著性差异（P<0.05）。C，D组治疗前后比较有显著性差异（P<0.05）。治疗后C，D组关节液中MDA和NO的含量均降低，与B组比较有显著性差异(P<0.05)，说明推拿加功能训练治疗膝骨关节炎能降低关节液中自由基MDA和NO的含量，阻止了氧自由基对软骨细胞的破坏，从而起到防治膝骨关节炎的作用。
       3  讨论
        3.1  关于动物模型  本实验采用膝关节石膏制动造模方法，膝关节长期固定，导致关节应力改变。制动建立的膝骨关节炎动物模型，在组织学及生化改变等方面酷似临床所见的膝骨关节炎，其机理主要在于［7］，兔膝关节伸直位固定时，由于限制了关节的运动，跨越关节的肌肉、关节囊持续收缩，使关节面的压力增加，同时异常压力状态下粘蛋白、透明质酸的成分减少，导致关节面的机械磨损；滑膜与软骨的粘连影响了软骨细胞营养的摄取，软骨细胞发生退变；关节局部血流滞缓，骨内压增高。
        3.2  自由基SOD，MDA和NO与膝骨关节炎的关系国内外学者认为膝骨关节炎是一种以关节软骨退变为中心的病理综合征。关节软骨是由维持功能的基质及软骨细胞组成，软骨基质的合成与降解平衡受着多种因素的调控，其中SOD，MDA和NO等活性分子起着重要作用。目前已有很多实验证实该类自由基是引起关节软骨退变及关节滑液改变的重要原因［8］。SOD是超氧阴离子的清除剂，MDA为脂质过氧化的产物，两者是检测机体血氧自由基水平的常用配对指标。SOD活力的高低间接反映机体清除氧自由基的能力，MDA含量的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，二者可作为动态评价OA防治效果的客观指标。OA病理状态下氧自由基含量增高，过量的氧自由基可抑制软骨细胞的增殖，引起软骨细胞死亡，抑制软骨基质蛋白多糖和胶原的合成，加速软骨基质的降解，导致软骨损伤。
        NO是一种较小的生物活性分子，在人体内以相对特异的方式控制多种细胞功能。研究证明，在某些炎性因子如白介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子（TNF-а）等刺激下关节内更易产生大量的NO，抑制软骨基质蛋白聚糖的合成，促进软骨基质中蛋白聚糖和胶原蛋白降解，抑制软骨基质的合成能力，通过NO依赖通路和促凋亡基因（Fas）介导的非NO依赖通路诱导软骨细胞凋亡［9］。
        3.3  推拿治疗膝骨关节炎的机理探讨膝关节骨关节炎属于中医“痹证”范畴，为本虚标实之证。中医推拿着眼于骨运动与软组织松解，以骨运动为主，侧重于松解膝关节周围软组织的粘连。推拿患部可使毛细血管扩张开放，改善局部血液循环促进淋巴循环和水肿增加肌肉神经的营养供给，加强软骨组织自身的吸收泵作用，缓解肌肉痉挛，消炎镇痛，从而进一步改善膝关节功能和关节积液的逐渐吸收。推拿手法功能训练可以驱邪止痛、益气行血、疏经通络，通过对髌骨抱揉和膝关节被动屈伸可以起到松解粘连、扩大关节间隙和滑利关节的作用［10］。实验表明，模型对照组动物治疗前后氧自由基清除剂SOD活性降低，而MDA的含量升高，说明整个KOA病变过程中始终存在着氧自由基对模型动物的损害。推拿加功能训练组，治疗后自由基清除剂SOD的活性显著提高，MDA的含量显著降低，从而避免了氧自由基及其代谢产物对局部的损害，说明推拿加功能训练和手法治疗可在一定程度上降低骨关节炎关节液中氧自由基含量，间接对关节组织起到保护作用，为该推拿加功能训练应用于OA的防治提供可靠的实验依据。
       【参考文献】
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