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       【摘要】 
       目的研究石蒜的指纹图谱。方法高效液相色谱法，紫外检测器(VWD)，乙腈-甲醇-水梯度洗脱；流速：1.0 ml/min；检测波长：232 nm。结果精密度、稳定性、重复性实验中各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<3％ ，10批样品间具有很高的相似度。同时对10批样品及比较样品中的3种生物碱含量进行测定。结论该方法可以作为石蒜药材的质量控制方法。
       【关键词】  石蒜 加兰他敏 指纹图谱 高效液相色谱
       Studies on the Fingerprint and Contents of Three Alkaloids in Lycoris radiate（L′Her.）Herb.
        JIA Xiaodong,   YAO Xinmei, CHEN Weimin, GUAN Zhijian,XU Xia,FENG Xu*
        (Jiangsu Center for Research & Development of Medicinal Plants,Jiangsu Institute of Botany,China Academic of Science/Nanjing Botanical Garden Mem. Sun Yat-Sen., Nanjing, 210014, China)
        Abstract：ObjectiveTo establish HPLC fingerprints of Lycoris radiate（L′Her.）Herb.．MethodsHPLC was applied on Agilent  1100 with VWD detector at 232nm and acetonitrile-methol-water solution,the flow rate was 1.0 ml/min. ResultsThe RSD of relative retention time and peak area of coexist peaks met to method requirement during the investigation of precision，stability and repeatibity trials．All of the 10 batches of samples shared a high similarity. At the same time, the contents of three alkaloids in 10 batch samples and other samples were determined. ConclusionThe fingerprint of Lycoris radiate（L′Her.）Herb. can be used as their characteristic chromatography fingerprint of Shisuan．
        Key words：Lycoris radiate（L′Her.）Herb.；  Galanthamine；  Fingerprint；  HPLC
        石蒜Lycoris radiate（L′Her.）Herb.为石蒜科石蒜属植物，又名龙爪花、红花石蒜等。鳞茎含有多种生物碱，药理实验证明其中的生物碱类具有多种活性。从石蒜中提取的加兰他敏已作为药物在包括美国、加拿大等23个国家批准和上市，用于治疗阿尔茨海默病(简称AD)［1］。加兰他敏、力可拉敏也已在临床用于治疗小儿麻痹后遗症。然而由于石蒜的品种繁多，每种之间成分含量有一定的差异，因此对石蒜建立合适的质量控制方法是很有必要的。国内石蒜的资源主要分布在江苏、浙江及安徽3省，占国内资源种类的80％ 以上［2］。按照国家药品监督管理局2000年颁发的“中药注射剂指纹图谱技术要求”的有关规定［3］，对产于江苏的不同采集地点的10批石蒜建立了HPLC指纹图谱方法。建立其指纹图谱是为了反映其质量情况，为建立稳定、可靠、全面的质量控制方法提供科学依据。同时对其中所含的3种生物碱的含量进行了测定。
       1  器材
        1.1  样品本实验植物样品包括产于江苏的石蒜Lycoris radiate（L′Her.）Herb.10份，产于湖南的石蒜1份，中国石蒜、忽地笑、换锦花各1份，其编号、采摘地点及采摘时间等见表1。样品采收后取鳞茎，洗净切小块，在60℃下烘干备用。
        1.2  对照品石蒜碱、力可拉敏、加兰他敏对照品，福建利科生物技术有限公司提供，批号：061210-2，纯度≥98％。
        1.3  试剂及仪器乙腈、甲醇：HPLC级；三乙胺：AR级；去离子水。美国Agilent公司1100液相色谱仪，HP Chemstation色谱工作站，紫外检测器（VWD），Phenoxmenex Gemini C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），Gemini预柱。
       2  方法
        2.1  色谱条件经方法学研究确定色谱条件，流动相A∶水（三乙胺调节pH值至9.0～9.2之间）；流动相B：乙腈；流动相C：甲醇。梯度洗脱程序见表2。柱温40℃；流速1.0 ml/min；检测波长232 nm；进样量10 μl。表1  植物样品的采集情况表2  梯度洗脱程序
        2.2  参照物标准液制备精密称取石蒜碱、力可拉敏、加兰他敏标准品，甲醇定容分别配成0.36，0.34，1.00 mg/ml的原液备用。
        2.3  供试液的制备取如上干燥植物样品，粉碎，过40目筛。精密称定6.0 g，置索氏提取器中，加10％的氢氧化钠10 ml混匀润湿，放置15 min。分别用25 ml醋酸乙酯在75℃水浴回流提取3次，第1次提取2 h，后两次均为1 h，合并提取液。过滤，减压蒸干，用少量甲醇溶解洗涤，定容至10 ml，用0.45 μm微孔滤膜滤过后作为供试品溶液。
        2.4  稳定性实验取石蒜5号样品供试液，分别在0，4，8，12，24 h检测指纹图。结果各色谱峰的相对保留时间和峰面积比值基本一致，RSD＜3％，供试品溶液在24 h内稳定，符合指纹图谱技术要求。
        2.5  精密度实验取石蒜11号样品供试液，连续进样5次，检测指纹图。比较各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积基本一致，RSD＜3％，符合指纹图谱的检测要求。
        2.6  重复性实验取石蒜3号样品5份，按供试品溶液制备方法制备供试品，检测指纹图。并分别按上述液相条件测定，对共有峰的相对保留时间和相对峰面积进行统计，5份供试品溶液的RSD＜3％，符合指纹图谱的要求。
        2.7  样品测定精密吸取标准对照品溶液和供试液各10 μl，分别注入液相色谱仪，按“2.1”项中色谱条件测定，即得。以石蒜碱色谱峰（S峰）的保留时间及峰面积为1，计算各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值。并按“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求”建立石蒜药材的指纹图谱检测标淮。
        2.8  生物碱含量测定将上述测定得到的标准对照品峰面积与样品相应峰面积进行比较计算，得到不同石蒜中3种生物碱的含量。
       3  结果
        3.1  相对保留值指纹图谱的建立采用相对保留时间标定指纹峰，记录70 min的色谱图，以图谱中石蒜碱为参照物（S），将各指纹峰保留时间与同一图谱中参照物的保留时间（设定为1）比较，其比值为各指纹峰的相对保留时间。计算10批药材指纹图谱中各指纹峰的技术参数（见表3），标定石蒜的特征指纹峰为15个（见图1）。各特征指纹峰的保留时间为：峰-1（7.524 min）；峰-2（11.607 min）；峰-3（13.643 min）；峰-4（19.739 min）；峰-5（24.299 min-S峰）；峰-6（26.217min）；峰-7（36.692 min）；峰-8（41.147 min）；峰-9（45.379min）；峰-10（46.504 min）；峰-11（48.161 min）；峰-12（51.382 min）；峰-13（57.137 min）；峰-14（67.382 min）；峰-15（69.385 min）。表3  10批药材指纹图谱中各指纹峰的技术参数
        3.2  共有指纹峰面积的比值通过10批药材测定，以图谱中石蒜碱为参照物（S），将各特征指纹峰面积与同一图谱中参照物的峰面积比较，其比值为特征指纹峰的相对峰面积。根据“中药注射剂指纹图谱研究的技术要求”规定，各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。峰-2，4，5，9单峰面积占总峰面积百分比＞10％，而＜20％，其差值＜25％；其余单峰面积比均＜10％，峰面积比值不做要求。符合指纹图谱的要求。
        3.3  非共有峰面积通过10批药材供试品的测定，统计非共有峰与总峰面积的百分比，其结果为非共有峰面积百分比＜10％，符合指纹图谱研究的检测要求。
        3.4  相似度结果采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》对各样品色谱图的原始文件（输出格式为aia）进行分析，自动匹配并以10批样品生成的对照谱图（中位数法）作为对照模版，计算各色谱图的整体相似度介于0.903～0.965之间（见表4）。10批药材具有很高的相似度。 表4  10批药材相似度
        3.5  与其它药材的比较同样条件下分别测定产于湖南的石蒜、中国石蒜、忽地笑、换锦花药材的色谱图，并与石蒜标准指纹图谱比较相似度，结果见表5。表5  与其它药材的比较结果
        3.6  生物碱的含量测定结果见表6。表6  不同石蒜中3种生物碱的含量
       4  讨论
        本研究采用HPLC技术，建立了石蒜药材的指纹图谱，并与其同属植物进行比较，同时对其中所含的3种生物碱的含量进行了测定。在实验色谱条件下，能得到较多的色谱峰且分离效果好，据此所得的相对保留值也十分稳定，所建立的色谱指纹谱具有较大的稳定性和可控性。该方法能得到石蒜药材所含组分的大量信息，其指纹谱能反映石蒜药材的内在品质，为快速鉴定石蒜类药材提供了方法。在得到指纹图谱的同时，3种主要的生物碱峰能呈现很好的分离，故可在测定指纹图谱的同时得到3种生物碱的含量，满足了多种需求，同时节省了试剂及时间。
        在供试品溶液制备方法考察中，对原有的传统石蒜生物碱提取方法进行了改进，摒弃氯仿这种提取溶剂，大大节省了提取步骤及时间。氢氧化钠预润湿提高了生物碱类成分的提取效率，所得到的指纹图谱经比较，峰形好且特征峰较多。
        本实验采取三相流动相，经反复摸索确定了如上的梯度洗脱条件。pH值的调节对峰形的重复性有很大的影响，故应每次预先配制大量足够的流动相，或精确配置温度及pH值，以减小对峰保留时间的影响。
        实验结果显示，产于江苏不同产地的石蒜药材指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，具有较高的相似度。所建立的指纹图谱稳定、可控，可用于石蒜类药材的质量控制及快速鉴定。湖南产石蒜与石蒜标准指纹图谱具有较高的相似度，显示有相近的化学成分。中国石蒜、换锦花、忽地笑与石蒜标准指纹图谱的相似度依次降低，同时各特征峰相对吸收面积有较大差异，特征峰的含量的差异可作为区分不同种源药材的科学标准。
        测定指纹图谱的同时可得到3种生物碱的含量，从结果中可看出，不同种源药材所含生物碱的量有较大的差异。因所选取的药材材料较少，本文中得出的中国石蒜、换锦花、忽地笑中3种生物碱的含量仅作比较之用，不具有代表性。
       【参考文献】
         ［1］ 鲍海鸥，陈波红．石蒜属植物资源的开发利用［J］.中国野生植物资源，1991，10(5)：31.
       
       ［2］ 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第16卷第1分册)［M］.北京：科学出版社，1989：16.
       
       ［3］ 国家药品监督管理局．中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)［J］.中成药，2000，22(10)：671.