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       【摘要】 
       目的研究葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin, GSPC)对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)大鼠肾脏功能蛋白的影响。方法建立T2DM大鼠模型，给予GSPC灌胃治疗12周，测定大鼠空腹血糖(FBG)、血脂(TG)、总胆固醇(TC)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的水平；测定胰岛素敏感指数(ISI)、肾脏肥大指数(KW/BW)和肾脏近端小管(proximal tubules, PT)钠泵活性。结果①与正常对照组比较，T2DM模型组大鼠FBG，TG，TC和KW/BW显著升高，SOD，NO，NOS，ISI和肾脏PT钠泵活性显著降低；②与T2DM模型组比较，GSPC治疗组大鼠TG，TC和KW/BW显著降低，SOD，NO，NOS，ISI和肾脏PT钠泵活性显著升高。结论 GSPC对T2DM大鼠肾脏功能蛋白具有一定的保护作用，其机制可能与GSPC降低动物体内氧化应急水平有关。
       【关键词】  原花青素 2型糖尿病 氧化应急 功能蛋白 大鼠
       
         Effect of Grape Seed Procyanidin on Renal Functional Protein of Type 2 Diabetic Rats 
        LIU Hong, ZHENG Qian,  CHEN Wuning, ZHANG Tuanxiao, JING Huae
        (North Sichuan Medical College, Nanchong,Sichuan 637100, China) 
        Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of grape seed procyanidin (GSPC) on renal functional protein of the type 2 diabetes mellitus (T2DM) rats.MethodsA model of T2DM was developed in male wistar rats. The diabetes rats were received GSPC (100 mg·kg-1·d-1) for 12 weeks. The following parameters were measured: the fasting blood sugar (FBG), blood fat (TG), total cholesterol (TC) level, KW/BW, insulin sensitivity index (ISI), superoxide dismutase (SOD), nitric oxide (NO), nitric oxide synthase (NOS) and sodium pump activity of kidney proximal tubules (PT).Results①Compared with normal control group, FBG, TG, TC level and KW/BW in the model control group were significantly increased and SOD, NO, NOS, ISI and sodium pump activity were significantly decreased; ②Compared with model control group, TG, TC level and KW/BW in the GSPC treat group were significantly decreased while SOD, NO, NOS, ISI and sodium pump activity were significantly increased. ConclusionGSPC can protect renal function in T2DM rats by decrcasing oxidative stress．
        Key words：Procyanidin;   Type 2 diabetes mellitus;   Oxidative stress;   Functional protein;   Rats
        葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin, GSPC)是从葡萄籽中提取出来的一类属于双黄酮衍生物的天然多酚化合物。动物实验表明，GSPC具有抗氧化、抗炎、抗动脉硬化及保护心血管等作用［1］。目前研究认为糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)的发生除了与高血糖有关外，也与糖尿病患者抗氧化应急能力下降［2］，炎症介质增加［3］，动脉粥样硬化有密切的联系。本实验室前期研究证实了糖尿病大鼠在尿液微球蛋白出现前，肾脏功能蛋白，特别是实现肾脏功能最关键的近端小管(proximal tubule, PT)管周膜上钠泵活性已经改变［4］，所以本实验用GSPC灌胃治疗T2DM大鼠，通过检测肾脏PT钠泵活性及血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)等的变化，从而研究GSPC对T2DM大鼠肾脏功能蛋白的保护作用与机理。
       1  材料与仪器
        1.1  动物及饲料  3月龄雄性Wistar大鼠，一级，体质量(195±16) g。动物合格证号：SCXK(川)2004-15。常规饲料：57%碳水化合物，22%蛋白质，6%脂肪，8%纤维素，7%其他成分。高能饲料(60%常规饲料，20%蔗糖，15%猪油，5%胆固醇)。动物及饲料均由四川省医学科学院实验动物研究所提供。
        1.2  试剂及仪器  GSPC(天津尖峰天然产物有限公司，纯度>95％)，STZ，Na2ATP，ouabain，胶原酶(Sigma公司)，EGTA(Gibco)，血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、SOD、NO和NOS检测试剂盒(南京建成生物公司)，胰岛素放免检测试剂盒(北京北方生物研究所)，［γ-32P］ ATP (北京福瑞特公司)，快速血糖测定仪及试纸(三诺SXT-1型，长沙)，SN-6930A型液闪仪与SN-6100型γ计数器(上海核所日环光电公司)。
       2  方法
        2.1  动物模型建立与分组 T2DM大鼠模型和正常对照组的建立参照本实验室以前的方法［4］。4周高能饲料喂养，空腹12 h后给予25 mg·kg-1的STZ一次性腹腔注射（STZ注射前用pH=4.2的柠檬酸缓冲液配成1%浓度），继续高能饲料喂养4周，然后采尾静脉血测定空腹血糖(FBG)、血清胰岛素(FINS)，并计算胰岛素敏感指数(ISI) ［5］，最后选取符合T2DM条件的20只大鼠作为T2DM模型，其余淘汰。将实验动物分为3组：正常对照组、模型对照组、治疗组。治疗组用GSPC 200 mg·kg-1·d-1（使用时用生理盐水配成1%的浓度）平均分两次灌胃治疗，对照组每次等量生理盐水溶液灌胃，在GSPC治疗期间，全部大鼠都用常规饲料喂养，自由饮水。实验动物于GSPC治疗12周末空腹12 h，然后从心脏采血制备血清标本待测，断髓处死动物，摘取右侧肾脏，去包膜后用滤纸吸干水分后称重，将右肾重量与体重量之比（KW/BW）作为肾脏肥大指数。左侧肾脏用于肾脏PT的微分离及其管周膜上钠泵活性测定。
        2.2  生化及放免检测  FBG采用快速血糖测定仪测定，TG，TC，SOD，NO和NOS的检测严格按照试剂盒说明书采用751分光光度计测定，FINS采用放射免疫分析法。
        2.3  单根PT的获取及其钠泵活性测定 参照我们以前的方法获得大鼠单根PT并测定小管钠泵活性［6］。获得的单根小管经过低渗冻融处理后，与1μl总ATPase测定液或Mg-ATPase测定液共同孵育，37℃ 15min，液闪仪测定孵育液中32Pi的每分钟计数(cpm)值，利用Concet公式计算出总ATPase或Mg-ATPase活性，两者差值即钠泵的活性，酶的活性用单位用pmol·mm-1·h-1表示。
        2.4  统计学处理  数据由作者采用SPSS10.0软件对各组数据行双侧t检验和单因素方差分析，计量结果均以±s表示，以P<0.05作为统计学检验标准。
       3  结果
        3.1  GSPC对T2DM大鼠一般症状体征的影响  与正常对照组大鼠比较，建立的T2DM模型大鼠体重明显增加，并出现腹型肥胖，多饮，多尿，多食症状，毛发凌乱晦暗，精神萎靡，活动减少，随着病程延长，除大鼠体重呈下降趋势外，其它症状更加明显；与模型对照组大鼠比较，GSPC治疗12周后，上述症状体征得到明显好转。                               
        3.2  GSPC对T2DM大鼠血糖血脂和肾脏肥大指数的影响由表1可见，与正常对照组比较，糖尿病模型对照组大鼠TC，TG，FBG水平显著升高(P<0.01)，肾脏肥大指数显著增大(P<0.05)；与模型对照组比较，GSPC治疗12 周后，大鼠TC，TG水平显著下降(P<0.01)，肾脏肥大指数显著降低(P<0.05)，FBG有下降趋势，但无明显统计学意义。表1  实验大鼠血液生化指标和肾脏肥大指数的变化与正常对照组比较，＊P<0.05，＊＊P<0.01；与模型对照组比较，＃P<0.05，＃＃P<0.01
        3.3  GSPC对T2DM大鼠体内抗氧化应急能力指标的影响 由表2可见，与正常对照组比较，糖尿病模型对照组大鼠SOD，NO，NOS水平显著降低(P<0.01)；与模型对照组比较，GSPC治疗12周后，大鼠SOD，NO，NOS水平显著升高(P<0.01)。表2  实验大鼠体内抗氧化应急能力指标的变化 与正常对照组比较，＊P<0.01；与模型对照组比较，＃P<0.01
        3.4  GSPC对T2DM大鼠血清胰岛素水平和胰岛素敏感指数的影响  由表3可见，与正常对照组比较，糖尿病模型对照组大鼠FINS水平显著升高，ISI显著降低(P<0.01)；与糖尿病模型对照组比较，GSPC治疗12周后，大鼠FINS水平显著降低(P<0.01)，ISI显著升高(P<0.05)。  表3  实验大鼠血清FINS，ISI和PT钠泵活性的影响与正常对照组比较，＊P<0.01；与模型对照组比较，＃P<0.05，＃＃P<0.01
        3.5  GSPC对T2DM大鼠肾脏近端小管钠泵活性的影响如表3，与正常对照组比较， T2DM模型对照组大鼠12周时PT钠泵活性显著降低(P<0.01)；与糖尿病模型对照组比较，GSPC治疗12周后，PT钠泵活性显著升高(P<0.01)。
       4  讨论
        在糖尿病患病人群中，90%以上属于T2DM，且绝大多数与肥胖密切相关，复制与人类T2DM发病过程和病理特征类似的模型是实验研究的关键。本实验疾病模型大鼠呈腹型肥胖，具有中度高血糖、高血脂、FINS水平升高和胰岛素抵抗的特点，同时还具有多饮多食多尿和精神活动下降的症状，这与人类T2DM十分类似，说明符合实验研究的要求。
        实验结果显示T2DM大鼠经过GSPC治疗12周后，血脂和总胆固醇水平明显降低。由于血脂和胆固醇长期异常升高可以导致患者肾小球硬化，这是DN发病机理之一［7］，所以GSPC通过降低血脂和胆固醇水平，可以防治糖尿病肾损害。治疗组大鼠ISI显著升高，血糖虽然未见显著性下降，但仍有下降趋势，并有可能阻止血糖进一步升高，当然这需要延长治疗时间才能确定。T2DM模型大鼠体内SOD，NO，NOS水平都显著下降，表明糖尿病大鼠体内抗氧化应急能力下降，而经GSPC治疗后，体内SOD，NO，NOS水平都显著升高，抗氧化应急能力增强，说明GSPC能够增强糖尿病大鼠体内的抗氧化应急能力。研究表明，糖尿病大鼠抗氧化应急能力增强，能够降低体内血浆糖基化终末产物的生成，抑制高糖介导的蛋白糖基化和糖自身氧化，从而阻止糖尿病肾组织炎症病变和纤维化［8］，另外，血脂胆固醇的降低也与GSPC提高机体抗氧化应急能力有关［7］。
        目前临床上通过检测患者尿中微球蛋白是否为阳性来诊断DN，但是当尿中出现微球蛋白时，往往提示患者已进入DN晚期，所以本实验通过检测肾脏组织中关键的功能蛋白-肾脏PT管周膜上钠泵的活性，观察糖尿病大鼠肾脏功能的早期损害及其GSPC对糖尿病早期肾脏功能的保护作用。T2DM大鼠12周时肾脏肥大指数显著升高，肾PT钠泵活性显著降低，表明此时糖尿病大鼠肾脏功能状态已有下降趋势。与模型对照组比较，GSPC治疗组大鼠肾脏PT钠泵活性显著升高，表明GSPC能够保护肾小管功能蛋白，同时肾肥大指数显著下降，也说明GSPC对糖尿病肾损害的保护作用。
        综上所述，GSPC具有保护T2DM大鼠肾脏功能蛋白的作用，其机制可能主要与GSPC提高糖尿病大鼠体内抗氧化应急能力、降低机体氧化水平有关。
       【参考文献】
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