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       【摘要】 
       目的测定蛇床子超临界二氧化碳（CO2）萃取物中蛇床子素和总香豆素的含量。方法 采用HPLC法和UV法对蛇床子中蛇床子素和总香豆素的含量进行测定。结果蛇床子素在0.275～2.20 μg范围内线性关系良好(r=0.999 8)；加样回收率为100.02%，RSD为1.05%。总香豆素在2.20～11.00 μg·ml-1范围内线性关系良好(r=0.999 7)；加样回收率为99.65% ，RSD为1.91%。结论该方法准确、灵敏、专属性强，可作为该萃取物的质量控制方法。
       【关键词】  蛇床子萃取物 蛇床子素 总香豆素高效液相色谱法；
       
       紫外-可见分光光度法蛇床子CO2超临界萃取物为伞形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.) Cuss.的干燥成熟果实经CO2超临界萃取所得到的液体，萃取物中主要含香豆素类及挥发油类成分，其中蛇床子素是香豆素类主要活性成分之一，具有抑制血小板聚集、抗病毒、抗突变、抗变态反应以及抑制血小板聚集等多种药理活性［1］。最新药理研究［2］表明蛇床子总香豆素对骨质疏松有明显的防治作用。其有效成分含量高低对其药用功效有重要影响。本实验采用HPLC法、UV法测定蛇床子素、总香豆素的含量，对蛇床子CO2超临界萃取物进行质量控制研究，为该样品的使用提供一个可行的质控方法，同时为抗骨质疏松新药的研究提供实验数据。
       1  仪器与试药
        岛津LC-20A型高效液相色谱仪，紫外检测器；UV-1800PC型紫外-可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；SB-2200型超声波清洗机(上海必能信超声有限公司)。对照品：蛇床子素（纯度98%，中国药品生物制品检定所提供），蛇床子CO2超临界萃取物（广州市美晨药业有限公司提供）；甲醇（色谱纯），二次重蒸馏水；0.45 μm微孔滤膜。
       2  方法与结果
        2.1  蛇床子素含量的测定
        2.1.1  色谱条件及系统适用性试验色谱柱为VP-ODS柱（4.6 mm ×150 mm,0.5 μm），色谱预柱（4.6 mm ×10 mm,0.5 μm）；流动相为甲醇-水(70∶30)；检测波长322 nm；柱温25 ℃；流速1 ml·min-1。
        精密吸取供试品和对照品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，蛇床子素出峰时间约为8.65 min，对照品、样品色谱图见图1～2。由图1～2可知，蛇床子素峰达到基线分离，理论塔板数为2 500，与其相邻色谱峰的分离度大于2.0。
        2.1.2  对照品溶液的制备精密称取蛇床子素对照品适量置于棕色的容量瓶中，加甲醇配制成0.11 mg·ml-1的对照品溶液，冷藏，备用。
        2.1.3  供试品溶液的制备精密称取CO2超临界萃取物100 mg，置于100 ml锥形瓶中，加入甲醇50 ml，密塞，超声提取30 min，放冷，过滤并定容于50 ml量瓶中，摇匀，经0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
        2.1.4  线性范围精密吸取对照品溶液0，2.5，5，10，15，20 μl进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，蛇床子素的进样量(X，μg)为横坐标，进行线性回归，得蛇床子素回归方程为Y=3 301 906.3193X+960 666.201 2，r=0.999 8。表明蛇床子素在0.275～2.20 μg范围内具有良好的线性关系。
        2.1.5  精密度实验精密吸取“2.1.2”中制备的对照品溶液20 μl，按“2.1.1”色谱条件，重复进样6次，记录蛇床子素峰面积，其RSD为0.89%，说明精密度良好。
        图1  蛇床子素对照品高效液相色谱图
        图2  蛇床子素样品高效液相色谱图
        2.1.6  重复性实验精密称取同一批超临界萃取物5份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法测定并计算蛇床子素含量，其RSD为1.30％。
        2.1.7  回收率实验精密称取已知含量超临界萃取物5份，分别加入蛇床子素对照品溶液3 ml，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法测定并计算蛇床子素含量，求得蛇床子素的平均回收率为100.02%，RSD为1.05%（n=5）。
        2.1.8  稳定性实验精密称取超临界萃取物，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h测定蛇床子素，记录相应峰面积，其RSD为1.93％，说明供试品溶液在24 h内基本保持稳定。
        2.1.9  样品测定按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法测定，用外标法计算蛇床子素含量为29.97%，RSD=1.93％（n=3）
        2.2  总香豆素含量测定
        2.2.1  线性范围精密吸取“2.1.2”中制备的蛇床子素对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml分别置于10 ml棕色的容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，在322 nm波长处测定吸收度，并以浓度C(μg·ml-1)为横坐标，吸收度A为纵坐标，进行线性回归，得线性方程为Y=0.063 8X+0.009 4，r=0.999 7。表明总香豆素在2.20～11.00 μg·ml-1范围内具有良好的线性关系。
        2.2.2  精密度实验精密量取“2.1.2”中制备的蛇床子素对照品溶液6份，置于50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按含量测定项下操作，测定吸收度，其RSD为0.97%，说明精密度良好。
        2.2.3  回收率实验精密吸取“2.1.7”项下供试品溶液0.3 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，在322 nm波长处测定吸收度，根据标准曲线计算总香豆素的含量，得总香豆素的回收率分别为99.65％，RSD为1.91%（n=5）。
        2.2.4  样品测定精密量取“2.1.9”供试品溶液0.3 ml，置50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，照分光光度法［3］，在322 nm波长处测定吸收度，根据标准曲线计算总香豆素的含量，样品的含量为38.45%，RSD为2.34%（n=3）。
       3  讨论
        曾选用乙腈-水（65∶35）、甲醇-水-乙酸（85∶15∶1）、甲醇-水（80∶20）、甲醇-水（75∶25）、甲醇-水（70∶30）作为流动相进行样品分析，结果表明，甲醇∶水（70∶30）作为流动相使样品峰形对称、分离度好，同时出峰时间较短，节省了分析时间。
        在制备供试品时，比较了用95%乙醇和甲醇提取，测试结果虽基本一致，但由于超临界萃取物中含有较多的脂溶性成分，用甲醇提取时发现有部分脂溶性成分浮在液面上不溶解，所以选用甲醇作溶剂进行提取，采用过滤的方法除去一部分脂溶性成分。
        文献曾报道［4］先采用柱层析对超临界萃取物进行预处理，除去脂溶性成分，该方法操作比较繁琐，本实验采用在分析柱前增加预柱以保护分析柱，不断更换预柱的方法，可避免前处理引起较大的误差。
        从图1超临界样品的色谱图看到，保留时间在8.65 min的色谱峰是蛇床子素，样品中蛇床子素的相对面积可达到73％以上，同时，笔者对超临界萃取后渣进行了分析，发现渣中蛇床子素含量很低，这表明采用超临界萃取法可以将蛇床子中蛇床子素基本提取完全。
        由结果表明，本法操作简便，结果准确，重复性好，可作为该提取物的质量控制的方法。
       【参考文献】
         ［1］ 陈 艳，张国刚，余仲平. 蛇床子的化学成分及药理作用的研究进展［J］.沈阳药科大学学报，2006，23（4）：256.
       
       ［2］ 鲍君杰，谢梅林，周 佳，等．蛇床子总香豆素对去卵巢大鼠骨质疏松的影响［J］.苏州大学学报，2005，25(3)：387.
       
       ［3］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录ⅴA.
       
       ［4］ 张晓霞，周卯星，张高勇，等. 高效液相色谱法测定蛇床子萃取物中的蛇床子素［J］.日用化学工业，2006，36（6）：395.