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       【摘要】 
       目的优选新伤去淤口服冻干颗粒的最佳提取工艺。方法以干膏率和丹酚酸B含量为考察指标,采用正交实验法对新伤去淤口服冻干颗粒的提取工艺进行优选。结果最佳提取工艺为：加水量为6倍，提取时间为1 h，提取次数为3次。结论 该提取工艺所得干膏率和丹酚酸B含量高。并经验证，合理可行。
       【关键词】  正交设计法 丹酚酸B 提取工艺 新伤去瘀口服
       
       冻干颗粒新伤去淤方是由我院骨伤科的名中医陈渭良主任医师总结个人临床经验，借鉴古方组方而成，主要由丹参、延胡索、三七、木香等组成，具有消肿止痛、活血化淤的功效，经多年临床验证，对跌打损伤、淤肿疼痛等有很好的疗效。自1999年起新伤去淤方，通过沸腾干燥法制成颗粒剂后，由于服用方便，曾经受到患者的喜爱，但原颗粒剂溶解性差、口感不好、服用量大的缺点逐渐显露出来，制约了该产品的应用。现采用冷冻干燥方法制得的产品具有遇水迅速溶解、溶解完全、不含赋形剂等优点，能够改善颗粒剂存在的缺点。但制备过程中，由于提取工艺不确定，浸膏质量不够稳定。为了保证产品质量，本文采用L9（34）正交实验法，通过正交实验，以干膏率和本方的君药丹参的水溶性有效成分丹酚酸B含量为指标，对提取条件进行考察，并对结果进行了方差分析及验证实验，优选出了最佳提取工艺条件。
       1  仪器与材料
        1.1  仪器 Lyo-20(CIP)冻干机(上海东富龙公司)，高效液相色谱仪（Waters-1525型泵，717进样阀，2996紫外检测器，800工作站）,多功能提取器。
        1.2  材料新伤去淤颗粒（由佛山市中医医院制剂中心提供）；丹参、延胡索、三七、木香等（购于佛山市药材公司，并经鉴定）；丹酚酸B对照品（中国药品生物制品检定所提供）；甲醇（色谱纯）；其他试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
        2.1  提取工艺研究
        2.1.1  操作方法按处方量称取药材,按正交表实验条件加规定水量依法煎煮，合并煎煮液，离心，浓缩后采用冷冻干燥的制备工艺及材料制成口服冻干粉，分装备用。
        2.1.2  提取工艺条件优化　采用正交设计实验(见表1)对煎煮条件进行优选,以干膏率和丹酚酸B含量为评价指标。结果见表2～4。
        2.2  干膏率的测定按处方中各药的比例，分别准确称取1/20处方量的药材，共重63.16 g，共9份，按正交设计分别进行水提过滤，滤液合并，浓缩至适量后，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，至105℃的烘箱中干燥3 h，移置干燥器中冷却0.5 h ,迅速精密称定重量，至恒重，以干燥品重量与药材重量之比，计算干膏率。结果见表2。
        2.3  丹酚酸B的含量测定
        2.3.1  色谱条件色谱柱为Xterra RP18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；检测波长286 nm；流速1.0 ml·min-1；进样量20 μl；柱温25℃［1］。
        2.3.2  供试品溶液的的制备取按正交设计工艺制备的样品0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率25 KHz）30 min，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
        2.3.3  对照品溶液的的制备精密称取丹酚酸B对照品适量，置10 ml碘量瓶中，加甲醇溶解，摇匀，制成浓度为1 mg﹒ml-1的对照品溶液。
        2.3.4  标准曲线的制备精密吸取上述对照品溶液30.0,25.0，20.0，15.0，10.0 μl，依选定的色谱条件进样测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程为：Y=4.71×105X-3.56×104，r=0.999 3。结果表明丹酚酸B在10～30 μg的范围内进样量与峰面积呈良好的线性关系。
        2.3.5  供试品溶液的含量测定分别精密量取按正交实验号制得的颗粒剂所得的供试品溶液20 μl注入色谱柱中，按上述条件及方法分析计算。结果见表2。表1  实验因素水平表2  正交实验及结果表3  干膏率方差分析表4  丹酚酸B总量方差分析
        2.4  结果分析　根据表2实验结果进行直观分析，水平优势均为：A1> A2 >A3; B3> B1 > B2; C3 > C1> C2，从而得出最优提取工艺为A1B3C3。各因素影响干膏率主次依次为A，C，B；各因素影响丹酚酸B主次依次为C，A，B 。对表2数据进行方差分析,结果见表3～4。可知:因素A，C对指标有显著影响，而因素B的影响不显著。为了节省能耗，因素B应选择B1 ，最佳工艺条件应为A1B1C3，即加水量为6倍，提取时间为1 h，提取次数为3次。
        2.5  验证实验为了验证上述结论的准确性，按照最佳工艺A1B1C3进行实验。结果见表5。表5  验证实验结果由表6结果可见， 其干膏率和丹酚酸B含量较上述实验结果都好，证明优化条件可行，所以水提取工艺定为A1B1C3。
       3  讨论
        新伤去淤口服冻干颗粒疗效的好坏，提取工艺是关键所在。首先应确立衡量水煮提取质量的指标，依此指标对各因素水平进行研究,才能避免水煮提取工艺的随意性、盲目性及产品质量的不稳定性。要使中药水煮提取工艺科学化,应尽可能溶解和浸出有效成分，避免溶解和浸出无效成分等杂质。丹参是该制剂的主药，丹酚酸Ｂ是丹参中主要的水溶性活性成分,具改善血液循环、抗氧化等作用［2～4］， 所以选择丹酚酸B含量作为水提取工艺优选的指标成分，利于优选出最佳的水提取工艺条件。
        由方差分析结果可以看出，对干膏率和丹酚酸B有影响的是加水量和提取次数,而煎煮时间没有影响，而且最佳水提取工艺条件是一致的，说明在此提取条件下，药材有效成分的提取是最完全的。综合以上结果可知，新伤去瘀口服冻干颗粒的最佳水提取工艺为：加水量为6倍，提取时间为1 h，提取次数为3次。通过正交实验法设计的新工艺,能不同程度地改善旧颗粒工艺的缺点，采用冷冻干燥方法制得的颗粒剂具有遇水迅速溶解、溶解完全、不含赋形剂等优点。
        
       【参考文献】
         ［1］ 国家药典委员会.中国药典高效液相色谱图集，第1卷［M］.北京：人民卫生出版社,2005：37.
       
       ［2］ 彭司勋,赵守训,廖清江,等.药物化学进展，第1卷［M］.北京:中国医药科技出版社，2000：201.
       
       ［3］ 中国医学科学院药物研究所.中草药现代研究，第2卷［M］.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1997：472.
       
       ［4］ 戈升荣,俞一心,谢更新.丹酚酸的药理作用研究进展［J］.中药材,2002,25(9)：683.