抗坏血酸有机锗倍半氧化物抑制鸡胚尿囊膜血管生成作用的研究
作者：陈芳 闫静 郭冷秋 贾桂芝 张基庆
作者单位：黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040
《时珍国医国药》 2009年 第4期
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【摘要】
目的研究抗坏血酸有机锗倍半氧化物对鸡胚尿囊膜(CAM)血管生成的抑制作用。方法在七日龄CAM上植入含不同剂量试药的甲基纤维素膜片，并孵化48 h。解剖显微镜下计数加药组和对照组局部血管数，以此来反映试药对CAM新生血管形成的影响。结果抗坏血酸有机锗倍半氧化物2.5，1.5，0.5 mg/egg剂量相关性减少CAM局部的血管数。结论 抗坏血酸有机锗倍半氧化物对CAM新生血管有显著的抑制作用。
【关键词】 抗坏血酸有机锗倍半氧化物 鸡胚尿囊膜(CAM) 抗血管生成
Antiangiogenesis Effect of Ascorbic Acid SesquioxyGe(Ⅳ) on Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane
CHEN Fang, YAN Jing*,GUO Lengqiu, JIA Guizhi, ZHANG Jiqing
(School of Pharmacology, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China)
Abstract：ObjectiveTo investigate the antiangiogenesis effect of the ascorbic Acid SesquioxyGe(Ⅳ) on chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM). MethodsThe ascorbic acid SesquioxyGe(Ⅳ) loaded with methylcellulose membranes was applied on chicken CAM surface of 7-day-old eggs and incubated for 48 hours .Local vessel density was measured under dissection microscope . The inhibitory effect on CAM angiogenesis was evaluated.ResultsThe Ge(Ⅳ) complex with ascorbic acid at 2.5，1.5 mg/egg and 0.5 mg/egg dose-dependently decreased the density of local blood vessels. ConclusionAscorbic acid SesquioxyGe(Ⅳ) significantly inhibits chicken CAM angiogenesis .
Key words：Ascorbic Acid SesquioxyGe(Ⅳ); Chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM); Antiangiogenesis
肿瘤生长和转移与新生血管的形成密切相关。临床与动物实验证明，当肿瘤组织生长超过2 mm3时，如果没有新生血管供应充足的氧气和营养物质，肿瘤组织将保持静止或发生退化。近年来,有研究发现某些化疗药物,在小剂量、高频率的给药方式下可以选择性地显著抑制肿瘤组织内新生血管内皮细胞的生长,使肿瘤细胞因为血供不足而生长受阻。这种特殊的给药模式,化疗药物的作用靶位已经不是肿瘤细胞,而是新生的血管内皮细胞,这就称为小剂量化疗(metronomic chemotherapy)或抗血管生成化疗( antiangiogenic chemotherapy)［1，2］。
因此新生血管生成是肿瘤生长和扩散的必要条件，抑制肿瘤血管的生成可以使肿瘤因缺氧、缺血而部分死亡，从而延缓肿瘤生长和抑制肿瘤转移［3］。开展抑制肿瘤血管的药物筛选研究目前已成为抗肿瘤研究的热点。有机锗化合物是人们熟知的具有广谱生物活性的有机化合物，特别是它的抗癌活性研究已引起人们的极大兴趣［4，5］。抗坏血酸有机锗倍半氧化物是本实验室研制合成的一种新型有机锗化合物，经动物肿瘤抑制实验证明，该化合物具有显著的抗肿瘤活性。鸡胚尿囊膜(CAM)是研究体内血管发生的常用模型之一［6，7］。本研究应用CAM技术，观察了抗坏血酸有机锗倍半氧化物对CAM血管生成的影响，从抗血管生成途径对抗坏血酸有机锗倍半氧化物的抗癌作用机制进行了初步探讨。
1 材料与仪器
1.1 动物与材料昆明种小鼠,体重(20 ±2) g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。小鼠S180腹水型瘤株由哈尔滨肿瘤医院实验动物中心提供。受精种蛋购于东北农业大学孵化场。
1.2 试剂 甲基纤维素（M450，英国进口分装，北京索莱宝科技有限公司哈尔滨分公司），丙酮（天津市化学试剂六厂三分厂），甲醇（北京化工厂），双蒸水（哈尔滨蒸馏水厂），新洁尔灭（齐齐哈尔市鹤城化学药物有限责任公司）。
1.3 仪器与设备恒温恒湿箱（SPX-250型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂），解剖镜（BA400/500型，麦克奥迪实业有限公司），净化工作台（SW-CJ-/F型，苏州型净化设备厂）。
2 方法
2.1 动物肿瘤抑制实验
2.1.1 药物处理因受药物溶解性和小鼠灌胃体积限制，以抗坏血酸有机锗倍半氧化物吐温80（2%水溶液）溶液0.18 g/ml对小鼠灌胃。环磷酰胺组给药为30 mg/kg［8］，即按小鼠平均体重20 g，每次给药量为0.5 ml计算，相当于环磷酰胺的浓度为0.0012 g/ml。
2.1.2 动物分组及处理取本实验室自行传代接种7～9 d的瘤源小鼠,取生长良好的乳白色腹水,以适量无菌生理盐水稀释成瘤细胞悬液,细胞数约为5×106/ml，在小鼠右腋窝皮下接种，每只0.2 ml 。次日，随机将小鼠分为5 组，每组10 只：生理盐水组、抗坏血酸有机锗倍半氧化物给药组（分高、中、低3个剂量）和环磷酰胺组，同时开始给药。本实验采用依次在接种后的第1，5，9天给药的给药方式［8］，于第11天处死小鼠，剥离皮下瘤块称重，计算抑瘤率。
2.2 抑制鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成的实验
2.2.1 鸡胚的处理 取重量相近（50±5）g，表面无污染、无破损，产出时间在1周以内的新鲜受精鸡卵，以0.1%新洁尔灭清洗，再用清水洗净后用纱布拭干。气室朝上，鸡蛋长轴与蛋托成约60°角，放在温度38 ℃, 相对湿度60%的孵箱内孵育,内置盛有0.1%新洁尔灭的湿盘，每天早晚各翻蛋1 次。
2.2.2 甲基纤维素膜片制备 用双蒸水配制浓度为0.5%的甲基纤维素溶液，过夜使甲基纤维素充分溶解，高压灭菌后备用。在超净台下将甲基纤维素溶液20 μl分多次重复加入同一凹槽内，超净台内吹干，制成直径约4 mm的膜。将膜片轻轻揭下，无菌保存备用（最好在24 h内使用）。
2.2.3 开窗加药 孵育至第7天，将鸡胚随机分成4组：高剂量实验组（2.5 mg/egg）［9］、中剂量实验组（1.5 mg/egg）、低剂量实验组（0.5 mg/egg）、空白对照组（甲基纤维素膜片）。在照蛋器指示下距胚头右下方1.0 cm 处做标记（此处为CAM血管较少的区域）,用 75%酒精消毒后,以标记处为中心开出一个1 cm ×1 cm 的小窗,用滴管滴加2 滴生理盐水使鸡胚绒毛尿囊膜下塌,与卵壳膜分离,用镊子和剪刀小心去除卵壳膜,暴露含有丰富血管的尿囊膜组织，将甲基纤维素膜片放置于CAM毛细血管新生区，然后在各组膜片上分别加各剂量的试药，用透明胶带封口，继续孵育48 h。
2.2.4 观察拍照 小心揭开透明胶带，暴露出加药区尿囊膜，每枚蛋滴加1∶1 的甲醇、丙酮混合固定液2.5 ml，室温下固定20 min, 待CAM 上血管内的血液凝固后，使CAM与蛋壳分离，分别以加药区和载体为中心剪下半径为5 mm的CAM， 移至玻璃片上，使其展开铺平，放到4×解剖显微镜下观察并拍照片［10］。
2.2.5 统计分析 解剖显微镜下观察，选取画面清晰者进行血管计数。计数5 mm 范围内血管数。
利用SPSS13.0软件对CMA实验数据分析，给药组与对照组相比有显著差异（P＜0.01﹚。
3 结果
3.1 抗坏血酸有机锗倍半氧化物对小鼠S180的抑制作用见表1，可见抗坏血酸有机锗倍半氧化物能明显减轻瘤重，利用SPSS13.0软件分析，给药组与生理盐水对照组相比有显著差异（P＜0.01﹚，且与剂量成正相关。实验重复3次，结果相近，取平均值。表1 不同剂量抗坏血酸有机锗倍半氧化物对小鼠S180的抑制作用（3 次平均）与对照组比较，＊＊P< 0.01；n=10
3.2 抑制鸡胚尿囊膜（CAM）血管生成实验
3.2.1 抗坏血酸有机锗倍半氧化物对CAM血管形成的抑制作用抗坏血酸有机锗倍半氧化物对7日龄鸡胚成活率基本没有影响，所以重点讨论它对鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管生成的抑制作用。
由图1和表2可知，高剂量实验组对血管生成有明显的抑制作用，中剂量实验组血管数量明显减少且出现受损情况，低剂量实验组的血管虽未出现破损现象，但血管变细。综合可知不同剂量的实验组对CAM血管生成具有不同程度的抑制作用。表2 不同剂量抗坏血酸有机锗倍半氧化物对CAM血管数目的影响
3.2.2 抗坏血酸有机锗倍半氧化物作用与剂量的相关性由表2和图1可见，抗坏血酸有机锗倍半氧化物的3个剂量组（2.5，1.5，0.5 mg/egg）均可以抑制CAM血管生长，但中、高剂量实验组的抑制作用更为明显，血管出现受损情况且数量明显减少。说明抗坏血酸有机锗倍半氧化物对血管生成的抑制作用与剂量正相关。
4 讨论
早在20世纪70年代，美国的Folkman博士就证实了肿瘤的生长和转移依赖于血管的生长这一假说。因此，抑制肿瘤血管生成，阻断肿瘤的营养供应，以达到控制肿瘤的生长和转移，对于实体肿瘤的治疗具有重要的意义。抗坏血酸有机锗倍半氧化物是我们实验室合成的一种新型有机锗化合物，在证明了其对小鼠S180和H22抗肿瘤作用后（另文报道），为进一步揭示其抗肿瘤的作用机制，我们应用鸡胚尿囊膜(CAM)模型首次证明了抗坏血酸有机锗倍半氧化物对肿瘤血管生成的抑制作用。鸡胚尿囊膜(CAM)方法是一种经典的研究新生血管的方法，采用7日龄的鸡胚，是因为尿囊膜上的微血管仍在进一步发展，且鸡胚已经具有抵抗外界环境的改变对它产生的影响的能力，减小了环境对鸡胚成活率和血管生成方面的影响。在选择载体方面，虽然是固体药物，但仍采用甲基纤维素做载体，以减少药物直接接触尿囊膜时对它产生的刺激。
实验结果表明，抗坏血酸有机锗倍半氧化物对于CAM血管形成具有较强的抑制作用，可能是一种具有应用前景的抗肿瘤药物，在抗肿瘤治疗中具有很大的潜在应用价值。
【参考文献】
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