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       【摘要】 
       目的研究大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法以市售大豆为材料，经酸浸、脱脂、硫酸铵沉淀、透析除盐、葡聚糖凝胶G-75柱纯化等方法进行大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提纯。然后，用大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃给药。通过比较正常对照组、实验对照组、大豆抑蛋白酶抑制剂高中低剂量组的多项血液指标（血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇）及各组小鼠病理切片等，研究大豆胰蛋白酶抑制剂的降糖活性。结果给予大豆胰蛋白酶抑制剂灌胃的糖尿病小鼠其血糖水平明显下降，甘油三酯水平下降，总胆固醇水平和高密度脂蛋白胆固醇水平无明显变化。结论大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对糖尿病有较显著的疗效。
       【关键词】  大豆 胰蛋白酶抑制剂 分离提纯 糖尿病 小鼠胰蛋白酶
       抑制剂（soybean trypsin inhibitor,SBTI）是一类可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽，普遍存在于植物的储藏器官，如种子、块根和块茎中［1］。大豆胰蛋白酶抑制剂已在多种医药领域有所应用［2,3］，另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果［4］，但未见SBTI对糖尿病治疗效果的专项研究，本文就大豆胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗作用进行研究和探索。
       1  材料与仪器
        1.1  试剂与药品市售大豆，牛胰蛋白酶(1∶250，上海维编科贸有限公司），BAPNA·HCl(Na-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐，上海维编科贸有限公司)，Tris(三羟甲基氨基甲烷，成都化学试剂厂生产)，Sephadex G-75（葡萄糖凝胶G-75，上海化学试剂厂生产），Alloxan（四氧嘧啶，sigma公司），葡萄糖试剂盒-GLU(氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司)，高密度脂蛋白胆固醇试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），甘油三酯试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），总胆固醇试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），肝素钠（江苏万邦生化医药股份有限公司），硫酸铵，正己烷，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，36%乙酸等均为国产分析纯。
        1.2  仪器DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂），DF206电热鼓风干燥机（北京医疗设备二厂），FA1004电子天平（科大创新股份有限公司中佳分公司），KDC-1042低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），AE240电子天平（METTLER公司）。
       2  方法与结果
        2.1  胰蛋白酶抑制剂的分离纯化
        2.1.1  大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）粗提物的制备用酸抽提法所得粗品蛋白和抑制剂总量高［1］，故本实验采用酸性水溶液浸泡大豆粉末提取大豆胰蛋白酶抑制剂［5,6］。
        2.1.2  大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物的透析除盐将抑制剂粗制备物置于透析袋中蒸馏水充分透析7 d，除去盐分。
        2.1.3  凝胶柱的制备及抑制剂粗提物的纯化［5,7］参考文献［5,7］中方法，吸出存留缓冲液，加入1 ml样品，用缓冲液进行洗脱，控制流速在2 ml·h-1。流出10 ml后，用干净的试管分部收集，检测每管抑制剂的活性。
        2.1.4  大豆胰蛋白酶抑制剂的活性测定［5,7］参考文献［7］中方法，以BAPNA为底物测定胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的活性。计算其抑制百分率［5］。收集具有抑制活性的洗脱液（即大豆胰蛋白酶抑制剂的提取物）。
        2.2  大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对小鼠血糖、甘油三酯、总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平的影响
        2.2.1  实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立随机选取10只小鼠作为正常对照组(Control)。除正常对照组外，其它小鼠禁食12 h后，腹腔注射四氧嘧啶250 mg·kg-1。72 h后尾尖取血，用葡萄糖氧化酶法测定注射四氧嘧啶小鼠的血糖，以血糖值大于11.1 mmol·L-1［8］的小鼠作为四氧嘧啶糖尿病模型小鼠。将糖尿病模型小鼠随机分为实验对照组(Alloxan) 、大豆胰蛋白酶抑制剂低剂量组(Alloxan+ SBTIL) 、大豆胰蛋白酶抑制剂中剂量组(Alloxan +SBTIM) 和大豆胰蛋白酶抑制剂高剂量组(Alloxan+SBTIH)。
        2.2.2  分组给药及测定方法Alloxan+SBTIL组、Alloxan+SBTIM组和Alloxan+ SBTIH组的定时给药剂量分别为每只每天0.1，0.3 ml和0.5 ml。但为了消除不同给药剂量对实验结果的影响，需将Alloxan+SBTIL组和Alloxan+SBTIM组的药液用蒸馏水稀释，使得稀释后药液的给药量为每只每天0.5 ml。Control组和Alloxan组给予等容量生理盐水（0.5 ml）。连续7 d经口灌胃给药。末次给药后次日分别测定各组小鼠的血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇4项血液指标（均采用试剂盒法，其具体操作过程见试剂盒内说明书）。完成测定后，处死小鼠，取肾脏和肝脏制作病理切片。
        2.2.3  大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病模型小鼠血糖水平的影响结果见表1。表1  对糖尿病模型小鼠血糖水平的影响由表1可见，造模72 h后，四氧嘧啶诱导的糖尿病模型小鼠的血糖水平均显著高于正常对照组（P＜0.01），并且糖尿病模型小鼠状态较为萎靡，表明糖尿病模型制造成功。对照实验后的各给药组和糖尿病模型小鼠的血糖水平可见大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病的降糖作用：由Alloxan组、Alloxan+SBTIL组、Alloxan+SBTIM组到Alloxan+ SBTIH组小鼠的血糖水平有逐渐降低的趋势，即血糖降低程度与给药剂量正相关。其中Alloxan+SBTIM组、Alloxan+SBTIH组与Alloxan组相比有明显降低（P＜0.01），尤以Alloxan+SBTIH组更为明显。结果表明，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病小鼠的血糖有较明显的降低作用。
        2.2.4  SBTI对糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C的影响结果见表2。表2  SBTI对糖尿病模型小鼠TG，CHO和HDL-C指标的影响与Control组比较，aP＜0.01，cP＜0.05；与Alloxan组比较，bP＜0.01
        本实验中，SBTI给药组的血清甘油三酯水平有所降低，其中大豆胰蛋白酶抑制剂高、中剂量给药组小鼠的甘油三酯水平与四氧嘧啶糖尿病模型组之间存在统计学差异（P＜0.01），可认为给药组小鼠血清甘油三酯水平明显降低。另一方面，SBTI对总胆固醇有一定的降低作用，对高密度脂蛋白胆固醇有一定的升高作用，但其差异不存在统计学差异（P＞0.05），即影响不显著。该实验结果在一定程度上补充说明了SBTI对糖尿病具有较好疗效。
        2.2.5  SBTI对糖尿病模型小鼠肾脏和肝脏细胞的病理切片显微镜观察结果比较观察图1～3，Control组小鼠肾脏细胞的组织切片中可见，其细胞形态为饱满，结构清晰，与周围细胞的界限较明显，细胞排列相对整齐；肾小球形态正常；近曲小管、远曲小管形状较规则，均匀排列。Alloxan组切片的细胞形态萎缩变形，轮廓不饱满，界限不清晰，细胞排列紊乱；肾小球固缩较明显，肾小球囊壁增厚；肾小管萎缩；间质组织细胞增生明显，有炎细胞浸润。Alloxan+SBTIH组细胞形态、界限、排列状况均较高血糖对照组有改善；肾小球固缩程度减轻；肾小管的形态、排列状况及间质增生情况也有改善。肾组织切片显示，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病模型小鼠的肾组织有一定的保护作用。
        比较观察图4～6，Control组小鼠肝脏切片中可见，肝小叶结构完整，形态饱满，界限清晰；肝板排列规则整齐，且较为紧密。Alloxan组切片肝脏细胞体积变小；胞质嗜酸性增强，细胞核染色较深；肝板排列较为疏松，且不整齐。高剂量给药组小鼠的肝小叶结构明显，肝板细胞体积增大，排列较整齐、规则。
       3  讨论
        血糖是糖尿病的主要表征，临床上以血糖值作为糖尿病的主要诊断依据。因此，血糖水平的降低程度可直接反映糖尿病的治疗效果。通过分析各组小鼠血糖水平的实验数据可得出，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病具有较好的治疗作用。
        四氧嘧啶糖尿病小鼠较正常小鼠的血清甘油三酯，胆固醇水平均有升高［9］。本实验中，SBTI给药组的血清甘油三酯水平有所降低，其中，SBTI高、中剂量给药组小鼠的甘油三酯水平与Alloxan组之间存在统计学差异（P＜0.01）。另一方面，SBTI对总胆固醇有一定的降低作用，对高密度脂蛋白胆固醇有一定的升高作用，但其差异不存在统计学差异（P＞0.05）。该实验结果在一定程度上补充说明了SBTI对糖尿病具有较好疗效。
        由于糖尿病小鼠胰岛素的缺乏会引起肝糖原合成减弱和分解过程加强加速，引起糖尿病的肝细胞体积减小，胞质嗜酸性增强，即肝细胞发生病变；糖尿病肾组织中肾小管的重吸收作用降低，大量葡萄糖由肾脏排出，病理性渗透性利尿，即肾细胞发生病变。而且，蛋白质、脂肪、水和电解质的代谢紊乱等也对肝肾细胞造成相应的损伤。因而，通过其肾、肝脏器质病变程度也可反映出治疗糖尿病药物的疗效。肾、肝的病理切片反映，给药组糖尿病小鼠的病情有一定程度的好转。
        从实验数据中可观察到，各大豆胰蛋白酶抑制剂给药组的CHO，HDL-C水平与Control组及Alloxan组之间均无统计学意义（P＞0.05）。因此，拟定在下一步研究中，通过四氧嘧啶和高糖高脂饲料诱导大鼠的高糖高脂糖尿病，研究大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病模型各项血脂指标的影响，进一步探索大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病的疗效。
        
       【参考文献】
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       ［3］ 蔡祖花，王凤山，张天民.胰蛋白酶抑制剂的临床研究概况［J］.中国生化药物杂志，2000，21（3）：157.
       
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