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       【摘要】 
       目的探讨白桃汤剂对Lewis肺癌模型小鼠的治疗作用及机制。方法复制C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型，将40只小鼠随机分成4组：分别为生理盐水组(A组)、白桃汤剂低剂量组(B组)、白桃汤剂高剂量组(C组)、顺铂(DDP)组(D组)，连续用药10 d，观察移殖瘤生长情况，并采用放射免疫法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6) 的水平。结果A组瘤体质量最重，与其他组比较差异均有显著性意义(P＜0.01)。D、C组均可升高血清TNF-α水平(与A组比较， P＜0.01或P＜0.05)，B、C组可显著降低IL-6水平(与A组比较，P＜0.01)。结论白桃汤剂的抑瘤作用可能与其能升高血清TNF-α水平，降低IL-6水平，提高免疫功能有关。
       【关键词】  白桃汤剂 肺肿瘤 疾病模型 小鼠
       
       当前，肺癌居我国城市人口肿瘤发病率的首位，已成为恶性肿瘤发病率和死亡率最高的肿瘤疾病，迄今尚无有效的治疗方法。目前医学界普遍认为，提高肺癌疗效的措施是进行多学科综合治疗，其中中医药治疗占有重要地位。白桃汤剂为民间祖传秘方，曾为不少病人解除过病痛，临床治愈率达76%。本实验观察白桃汤剂治疗Lewis肺癌小鼠的疗效及机制，旨在为该药在临床上的进一步应用提供科学依据。
       1    材料与仪器
        1.1    细胞株  小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)，为小鼠高转移和耐药肿瘤细胞株(购于中科院上海细胞库)。
        1.2  动物  C57BL/6纯系小鼠，6～8周龄，体重（18±1）g，雌雄各半，吉林省长春市生物制品研究所提供(合格证号:0004088)。
        1.3  试剂与仪器  细胞因子中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)检测采用核素放免法，试剂盒由解放军总医院科技开发中心放免所提供；SN-695B型放免γ测量仪(上海日环仪器厂)；10%胎牛血清（FBS）（杭州四季青公司），DMEM培养基、胰酶（美国GICBO公司）。CO2恒温孵箱（日本SHEL-LAB公司），倒置显微镜（重庆光学仪器厂）。
       2  方法
        2.1  药物  白桃汤剂方由核桃皮15 g，白附子15 g，甘草10 g，黄芪20 g等组成（吉林医药学院自制）。按常规方法制成1 g/ml保存备用。注射用顺铂（DDP）（齐鲁制药厂生产，国药准字H37021358），10 mg/瓶，，用生理盐水稀释成0.2 mg/ml。
        2.2  方法将小鼠Lewis肺癌细胞置于含10%胎牛血清及DMEM的完全培养液中，在37℃，5%CO2培养箱中培养，2～3 d更换一次培养液，0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞总数达到要求后，台朌蓝拒染法测定活细胞数＞95%，调节细胞浓度为5×106/ml的细胞悬液备用。
        造模：取40只小鼠，雌雄各半，体重（18±1）g，于腋后线第6肋间胸腔接种，每只接种0.2 ml，细胞计数为5×106 个细胞/ml。建立小鼠肿瘤动物模型。
        造模2 d后随机分成4组，每组10只。生理盐水组(A组)：给予生理盐水0.2 ml灌胃，1次/d；白桃汤剂低剂量组(B组)：0.2 ml药液灌胃（相当于40 mg/kg），1次/d；白桃汤剂高剂量组(C组)：0.6ml药液灌胃（相当于120 mg/kg），1次/d；顺铂(DDP)组(D组),用量1 mg/kg，腹腔注射，1次/d，同时以生理盐水0.2 ml灌胃。各组均连续给药10 d。第12天处死全部小鼠进行指标检测。
        2.3  观察指标
        2.3.1  一般检测  观察接种前后各组小鼠的饮食情况、活动、毛色、大便状况等，绘制肿瘤生长曲线，完全剥离肿瘤称重，计算抑瘤率：抑瘤率（%）=（生理盐水组瘤重-治疗组瘤重）/生理盐水组瘤重×100%。
        2.3.2  瘤组织病理学变化取瘤组织10%甲醛固定,常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜观察；细胞因子TNF-α，IL-6水平检测，按试剂盒说明进行检测。
        2.4  统计学处理  所有数据用±s表示，采用组间t检验，多样本均数间多重比较的方差分析及q检验，数据分析采用SPSS10.0统计软件完成。
       3  结果
        3.1    药物对肿瘤生长的影响  接种后前两天移植瘤生长基本相同，从第5天开始，生理盐水组移植瘤生长明显快于其他组，病程中小鼠活动减少，睡眠减少，皮毛失去光泽，常有蜷曲、脱落现象。各用药组对移植瘤生长均有抑制作用，各组对Lewis肺癌小鼠肺癌组织的抑制作用见表1。 表1  各组给药后的瘤体重量及抑瘤率的比较与A组比较，* P＜0.01；与B组比较，⊿P＜0.01；n =10
        3.2  移植瘤组织病理学变化  移植瘤呈圆形、椭圆形或分叶状生长，质地硬，切面灰白，大部分与周围组织分界清楚。镜下移植瘤细胞形状不规则，大小不一，核大，浓染，核异形性明显，可见病理性核分裂相，核质比例明显增大，并可见血管增生，以间质及肿瘤边缘为主。各组内均可见组织坏死区，A组相对较少。B、C、D组癌细胞出现不同程度的退变，可见明显的坏死区，C、D组间质中血管成分明显减少。各组细胞因子比较见表2。表2  各组给药后的瘤体重量及抑瘤率的比较与A组比较，①P＜0.05，②P＜0.01；与A、D组比较，③P＜0.01；与B、C组比较，④P＜0.01；n =10
       4  讨论
        本实验用白桃汤剂作用于C57BL/6小鼠Lewis肺癌，从实验结果可见无论是高剂量或低剂量的白桃汤剂均能显著抑制肺癌在小鼠体内的生长，与生理盐水组比较差异有显著性意义（P＜0.01），抑瘤率达29.7%，45.8%，显示出较强的抑瘤活性，但弱于化疗组。
        TNF-α是由激活的单核一巨噬细胞产生的一种具有多种生物活性的多肽细胞因子，也是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子，除了对肿瘤细胞本身具有细胞毒性之外，它也能摧毁实体瘤周围的血管上皮组织，并且通过血栓的形成，阻断肿瘤的血液营养供应，最终导致肿瘤的出血性坏死、消退或消失。超过一定浓度的TNF-α具有明显的抗新生血管形成作用，TNF-α还能明显降低实体瘤周围间隙组织的压力，扩大肿瘤周围上皮组织的间隙，改变周围血管的通透性，使化疗的药物到达靶组织周围。另外，TNF-α通过对人体免疫系统的调节而加强自身的抗肿瘤作用［1］。治疗措施的实施对血清TNF-α水平有影响，如李宏云等［2］研究表明，肺癌患者应用化疗药物后1周内血清TNF显著升高，然后逐渐下降，于化疗结束后2周时又降至化疗前水平，认为化疗后血清TNF水平升高，可直接杀伤肿瘤细胞。本研究表明，化疗组、中药组血清TNF-α水平显著性升高，提示化疗或中药治疗都能在一定程度上激活TNF-α分泌，直接或间接杀伤肿瘤细胞。而两组肿瘤质量比较无显著性差异，说明对于Lewis肺癌的小鼠，化疗药物与中药相比，在缩小瘤体方面并无明显优势，这对临床上肺癌病人的化疗具有一定指导意义。
        IL-6是一种糖蛋白，由212个氨基酸编码组成。已发现肿瘤患者IL-6水平升高［3］；有报道［4］肿瘤细胞可释放较高含量的IL-6，特别是肺癌伴淋巴结转移患者IL-6水平大幅度升高(高于正常值近2.5倍)，认为IL-6水平上升可能预示着肺癌患者病情进一步恶化，或肿瘤发生转移；余寿益等［5］研究发现77.8%的肺癌患者血清IL-6水平明显高于正常对照组，肺癌晚期尤为显著，提示IL-6对肺癌细胞的生长与转移可能起促进作用。IL-6也参与恶液质过程，用Lewis肺癌细胞株接种纯种C57小鼠可建立恶病质的动物模型，随着肿瘤体积不断增大，小鼠明显消瘦，处于恶液质状态，血清IL-1，IL-6，TNF-α水平显著高于正常对照组［6］。本研究表明，中药组与模型组及化疗组比较IL-6水平均显著性降低(P＜0.01)，表明中药健脾治疗具有显著降低血清IL-6水平的作用，从而改善机体恶液质状态，这可能是中药治疗的重要作用机制之一。D组IL-6水平显著性高于B、C组(P＜0.01)，反应了化疗可进一步加重小鼠的脾虚状态。
        白桃汤剂方主要由核桃皮、白附子、黄芪、甘草等组成，根据中医“扶正祛邪”的原则，具有清热解毒、消肿散结、健脾益气的作用，各中药间互相配合，共奏化瘀解毒、消肿散结、益气养血的功效，使癌瘤逐渐消散，祛邪而不伤正。本研究认为，白桃汤剂既增强了机体的免疫功能，又具有抑瘤效果好而毒副作用小的优点，为临床治疗肺癌提供了一定的依据。
        
       【参考文献】
         ［1］ 吕志敢，郭 政.肿瘤坏死因子的研究进展［J］.山西医科大学学报，2006，37(3):311.
       
       ［2］ 李宏云，郑 红，姚反修，等.化疗药物对肺癌患者血清肿瘤坏死因子的影响［J］.河南医科大学学报，2001，36 (3):337.
       
       ［3］ 周志伟, 莫海山, 梁 晖.肺癌患者血清白细胞介素6,8,18的测定及其临床意义［J］.肿瘤研究与临床,2006,18(11):739.
       
       ［4］ 陈春莉, 桂淑玉 . 肺癌患者血清IL-6、IL-8和IL-10检测及临床意义［J］. 安徽医科大学学报 ,2003, 38(6):450.
       
       ［5］ 余寿益，田华琴，黄志庆，等.肺癌患者血清sIL-R2、IL-6和TNF-α水平的测定及其临床意义［J］.癌症，2002，19(10) : 945.
       
       ［6］ 陶志广， 周岱翰，陈林香，等.参茂固本方治疗脾虚荷Lewis肺癌小鼠的实验研究［J］.广州中医药大学学报,2008,25(1):56.