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       【摘要】 
       目的观察姜黄素对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的影响。方法四氯化碳加酒精制备大鼠肝纤维化模型，设正常对照组、病理模型组、姜黄素小剂量组、姜黄素中剂量组、姜黄素大剂量组、γ-干扰素组、复方鳖甲软肝片组。治疗结束后肝组织作HE染色、胶原纤维染色、网状纤维染色观察肝组织纤维化程度；免疫组织化学方法（SABC法）检测肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的含量。结果和病理模型组比较，姜黄素大剂量组大鼠、姜黄素中剂量组大鼠SSS计分值明显降低（P<0.05），肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原含量明显降低，有显著性差异（P<0.05）。结论姜黄素能够降低肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原含量，降解肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原，具有治疗肝纤维化的作用。
       【关键词】  姜黄素 肝纤维化 大鼠 胶原纤维
       
       Effect of Curcumin on the Type Ⅰ,Ⅱ and Ⅳ Collagens of Liver Tissues in Rats with Liver Fibrosis
        SONG Jian1, LIU Lijun2, SUN Shoucai1
        (1.Shanxi University of TCM, Xianyang, Shanxi 712046, China; 2.Shanxi Hospital of TCM, Xian, Shanxi 710003, China)
        Abstract：ObjectiveTo study the effect of Curcumin on the type Ⅰ,Ⅱ and Ⅳ collagens of liver tissues in rats with Liver Fibrosis.MethodsAn animal model of liver fibrosis was made by subcutaneous injection of carbon tetrachloride and ethanol orally and randomly divided into blank control group, model control group, small curcumin group, middle curcumin group, large Curcumin group, γ-interferon group and Compound Biejiaruangan Tablet group.The degree of liver fibrosis was detected by H.E. staining, collagen fibre and reticular fibre staining. The contents of type Ⅰ,Ⅱ and Ⅳ collagens of liver tissues were detected by immunocytochemistry SABC method.ResultsThe results showed that SSS scores in large and middle curcumin group were significantly lower than that of model control group (P＜0.05), and so did the content of type Ⅰ,Ⅱ and Ⅳ collagens of liver tissues.ConclusionCurcumin can degrade the type Ⅰ,Ⅱ and Ⅳ collagens of liver tissues and promote the recovery of liver fibrosis.
        Key words：Curcumin;  Liver fibrosis;  Rats;  Collagen fibre
        姜黄素是从姜黄属中药中提取的一种酚性色素，近年研究发现具有抗肝纤维化作用。本实验观察了姜黄素对肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原的影响，以期了解姜黄素抗肝纤维化的作用机理。
       1  材料
        1.1  动物   一级SD大鼠96只，雄性，体重（200±20） g，由西安交通大学医学院实验动物中心购进。动物合格证号：医动字第08-005号。
        1.2  药物及试剂CCl4分析纯，西安化学试剂厂生产，批号050124。姜黄素粉，分子式C21H20O6 上海试剂三厂生产，批号050124，25 g/瓶，用0.5%羧甲基纤维素纳制成混悬液备用［1］，浓度分别为10，20，40 mg/ml。羧甲基纤维素钠：上海山浦化工有限公司生产，500 g/瓶，批号20050118。75%乙醇，500 ml/瓶，陕西祥泰药业有限公司生产，批号050302。复方鳖甲软肝片：内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司出品，0.5 g/片，生产批号20041204，用蒸馏水溶解62.5 mg/ml备用。注射用重组人γ-干扰素（IFN-γ）：丽珠生物工程制药厂出品，100 万u/支，生产批号20050201，用注射用水溶为80 u/ml备用。 Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原抗体，均为0.2 ml浓缩性，由武汉博士德生物制品有限公司生产，中国人民解放军第四军医大学病理教研室提供，批号200510。     
       2  方法
        2.1  动物模型制备［2］及分组将实验大鼠适应性喂养1周后，随机抽取12只作为正常对照组（A组），其余84只大鼠实验第1天每只皮下注射50%四氯化碳植物油溶液0.5 ml /100 g体重,以后每3天皮下注射50%四氯化碳植物油溶液0.3 ml /100 g体重造模，从造模第2周开始给大鼠用25%酒精灌胃0.5 ml/100 g体重，隔天1次，第6周起，每周末从造模动物中随机处死1只大鼠作肝纤维化病理学检查，按照2000年西安会议《病毒性肝炎防治方案》肝纤维化分期标准来判断肝纤维化程度［3］，直到有2期以上纤维化形成，即确定肝纤维化模型复制成功，造模共12周。造模结束时大鼠死亡5只，将剩余72只大鼠随机分为6组：病理模型组(B组)、姜黄素小剂量组(C组)、姜黄素中剂量组(D组)、姜黄素大剂量组(E组) 、γ-干扰素组(F组)、复方鳖甲软肝片组(G组)，每组12只。
        2.2  治疗给药从第13周起开始给药，A组、B组用生理盐水灌胃，2 ml/只，1次/d，连续用药8周；C组以姜黄素100 mg/kg体重灌胃，1次/d，连续用药8周；D组以姜黄素200 mg/kg体重灌胃［4］，1次/d，连续用药8周；E组以姜黄素400 mg/kg体重灌胃，1次/d，连续用药8周；F组以γ-干扰素0.2 mu/kg体重肌肉注射，1次/d，连续用药8周；G组以复方鳖甲软肝片0.625 g/kg体重灌胃，1次/d，连续用药8周。各治疗组的给药剂量按成人常用剂量换算所得用量进行实验［2］。
        2.3  标本的采集与制备［5］治疗结束分别给大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.35 ml/100 g麻醉,颈总动脉取血，2 ml/只，分离血清备检（肝纤维化血清指标检测）。与此同时开腹剖取新鲜肝组织左叶，10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，厚5 μm 。
        2.4  观测指标及检测方法
        2.4.1  常规病理学检查将各组石蜡切片均作常规HE染色、胶原纤维染色（用Van-Gieson染色法，胶原纤维呈品红色［6］）、网状纤维染色（用Gomori染色法，网状纤维呈黑色［6］），同时进行肝纤维化组织学半定量计分系统（SSS）标准计分［7］。见表1。表1  纤维化半定量计分系统标准
        2.4.2  免疫组织化学检测将各组石蜡切片均作Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原免疫组织化学染色（SABC染色，DAB显色，均按试剂盒说明进行操作）。光镜观察肝组织病变与胶原的分布，免疫组化染色以汇管区、中央静脉及细胞浆膜或间质有棕黄色颗粒或线状条索状沉积为阳性。将胶原免疫组化结果经图像分析［8］：采用江苏捷达形态学分析软件（JEDA801D）处理，测定各组Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原面积百分比=胶原面积/肝组织面积×100%。
        2.4.3  统计学处理数据以±s表示，采用统计软件SPSS12.0中one way-ANOVA进行单因素方差分析，并用LSD法进行两两比较、相关性检验。
       3  结果
        3.1  动物死亡情况  造模结束时，大鼠死亡5只，死亡率为6.5%；治疗结束时，A，E，C组大鼠无死亡，死亡率为0；D组和F组各死亡1只，死亡率为8.3%；B，G组大鼠各死亡2只，死亡率为16.7%。
        3.2  肝纤维化组织学半定量计分系统（SSS）计分结果①与正常对照组比较，病理模型组计分明显增高（P<0.01），说明造模后肝组织结构发生明显变化；②姜黄素小剂量组与病理模型组无差异（P>0.05）；③姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组与病理模型组比较SSS计分明显降低，有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；④姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组之间无差异（P>0.05）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素与姜黄素小剂量比较有差异（P<0.05）。见表2。表2  肝纤维化组织学半定量计分系统与正常对照组比较，★★P<0.01；与病理模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与姜黄素小剂量组比较，△P<0.05
        3.3  各组大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原免疫组织化学指标检测
        3.3.1  肝组织Ⅰ型胶原检测结果与正常对照组比较，病理模型组计分显示，肝组织Ⅰ型胶原增生明显，有显著性差异（P<0.01）；姜黄素小剂量组与病理模型组比较，Ⅰ型胶原含量无差异（P>0.05）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组与病理模型组比较Ⅰ型胶原含量明显降低，有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组之间无明显差异（P>0.05）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组与姜黄素小剂量组比较Ⅰ型胶原含量明显降低，有明显差异（P<0.05或P<0.01）。见表3。表3  肝组织Ⅰ型胶原面积/肝组织面积统计结果与正常对照组比较，★★P<0.01；与病理模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与姜黄素小剂量组比较，△P<0.05，△△ P<0.01
        3.3.2  肝组织Ⅲ胶原的检测结果与正常对照组比较，病理模型组计分显示，肝组织中Ⅲ型胶原增生明显，有显著性差异（P<0.01）；姜黄素小剂量组与病理模型组比较，肝组织中Ⅲ型胶原含量无明显差异（P>0.05）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组与病理模型组比较，肝组织中Ⅲ型胶原含量明显降低，有显著性差异（P<0.05或P<0.01）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组织之间无差异（P>0.05）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组与姜黄素小剂量组比较，肝组织中Ⅲ型胶原含量明显降低，有显著性差异（P<0.05）。见表4。表4  肝组织Ⅲ型胶原面积/肝组织面积统计结果与正常对照组比较，★★P<0.01；与病理模型组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01；与姜黄素小剂量组比较，△P<0.05
        3.3.3  肝组织Ⅳ型胶原的检测结果与正常对照组比较，病理模型组计分显示，肝组织Ⅳ型胶原增生明显，有显著性差异（P<0.01）；姜黄素小剂量组与病理模型组比较，肝组织Ⅳ型胶原含量无明显差异（P>0.05）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组与模型对照组比较，肝组织Ⅳ型胶原含量明显降低，有显著性差异（P<0.05）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组之间无明显差异（P>0.05）；姜黄素大剂量、姜黄素中剂量、复方鳖甲软肝片、γ-干扰素4个治疗组与姜黄素小剂量组比较，肝组织Ⅳ型胶原含量明显降低，有显著性差异（P<0.05）。见表5。表5  肝组织中Ⅳ型胶原统计结果与正常对照组比较，★★P<0.01；与病理模型组比较，▲P<0.05；与姜黄素小剂量组比较，△P<0.05
       4  讨论
        肝纤维化是由于胶原和其它细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致ECM在肝内过量沉积。肝脏受损时，胶原合成逐步增多，降解逐步减少，可导致胶原的大量沉积，此时肝内胶原增加5倍以上，主要为Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原明显增多，其中以Ⅰ型胶原增生最明显，故检测Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原这3个指标的变化对于了解肝纤维化程度及药物的治疗效果具有重要意义。本实验研究显示，姜黄素可以改善肝纤维化时肝组织病理学结构，可以降低肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原含量，从而能够促进肝内ECM的降解，因此对肝纤维化的治疗有确切的效果；姜黄素在降低肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原含量及改善肝纤维化时肝组织病理学结构方面，其效果与复方鳖甲软肝片和γ-干扰素基本相同；姜黄素对肝纤维化的治疗有一定的量效范围，大剂量、中剂量有确切的效果，小剂量则无治疗作用；姜黄素对肝纤维化的治疗机理可能与其降解肝组织Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ型胶原有关。
       【参考文献】
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