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       【摘要】 
       目的研究白花蛇舌草对人肺巨细胞癌细胞株PG细胞bcl-2基因表达的影响，以探讨其抗肿瘤的作用机制。方法用不同浓度的白花蛇舌草含药血清分别处理人肺巨细胞癌细胞株PG细胞，采用流式细胞仪法观察其对PG细胞bcl-2基因表达的影响。结果经白花蛇舌草含药血清作用的PG细胞bcl-2基因表达明显降低。结论白花蛇舌草抗肿瘤作用机制可能与bcl-2基因表达减少有关。
       【关键词】  白花蛇舌草 肺癌细胞PG bcl-2
       Effect of Herba Hedyotis Diffusae on BCL-2 Gene Expression on PG Cell 
        LI Jie
        （Shandong University of TCM, Jinan 250355，China）
        Abstract：ObjectiveTo investigate the anti-cancer mechanism of Herba Hedyotis Diffusae in PG cell by observing the expression of bcl-2 gene in vitro.MethodsFCM was used to detect the expression of bcl-2 gene. ResultsThe bcl-2 gene expression of PG cell was decreased significantly by Herba Hedyotis Diffusae. ConclusionThe anti-cancer mechanism of Herba Hedyotis Diffusae maybe related to the decrease of the expression of bcl-2 gene.
        Key words：Herba Hedyotis Diffusae;   PG cell;   bcl-2 gene
        中药白花蛇舌草(Herba Hedyotis Diffusae)为茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa Willd.的干燥全草，具有清热、利湿、解毒、消痈之功效，主治肺热喘咳、痈肿疔疮、毒蛇咬伤等证。临床上广泛应用于各种癌症的治疗，尤多用于治疗消化系统肿瘤如食道癌、胃癌、肝癌、直肠癌以及子宫癌、淋巴癌、鼻咽癌等。现代药理研究表明白花蛇舌草具有抗肿瘤、抗菌、消炎等活性。在多种肿瘤组织中，由于bcl-2基因异常的高表达，可使肿瘤细胞群逃避和减少凋亡，造成增殖细胞群的细胞数量增多。本实验研究从bcl-2基因表达的角度来探讨白花蛇舌草的抗肿瘤作用机制,以期为白花蛇舌草抗肿瘤新药的开发和研制提供依据。
       1  器材与试剂
        1.1  材料白花蛇舌草Herba Hedyotis Diffusae购自济南市建联中药店，并由山东中医药大学药学院生药系石俊英教授鉴定。人肺巨细胞癌细胞株PG细胞，由山东省医学科学院基础所提供。
        1.2  动物   Wistar大鼠，雄性，体重200～240g，由山东中医药大学实验动物中心提供。
        1.3  仪器与试剂流式细胞仪(FACScan型,美国BD公司)，倒置相差显微镜（美国AO），CO2培养箱，超低温冰箱，超净工作台(BCM1000型,苏州净化设备有限公司)。
        藻红蛋白（PE）荧光素标记的鼠抗人bcl-2单抗IgG1及用于免疫阴性对照IgG1-PE（美国Pharmingen公司），RPMI1640培养基（Gibco公司），小牛血清（杭州四季青生物材料研究所），顺铂(DDP)（齐鲁制药有限公司），胰蛋白酶（GIBCO分装，伯安生命技术有限公司）。
       2  方法与结果
        2.1  白花蛇舌草水提取物的制备   称取白花蛇舌草200 g，加适量水浸泡1～2 h，水煎煮提取两次，合并提取液，浓缩成一定浓度（剂量为50 g生药/kg），即得白花蛇舌草水提取物。
        2.2  含药血清的制备取Wistar大鼠20只，随机分成正常血清组10只，含药血清组10只。含药血清组每日分别用白花蛇舌草4 ml/次，2次/d灌胃，正常血清组每日给予等量生理盐水灌胃，连续给药3 d。末次给药后1 h，乙醚麻醉，腹主动脉无菌采血，置无菌离心管离心10 min（1500 r/min），无菌分离血清，经56℃，30 min 灭活，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，分装入小瓶，置-20℃冰箱保存备用。
        2.3  流式细胞仪检测取对数生长期的PG细胞，经0.25%胰酶消化，计数，以2×105/ml的量接种于培养瓶中，37℃5% CO2含10%小牛血清的1 640培养基中培养24 h，至细胞生长旺盛贴壁后,去掉原培养液，分别加入不同浓度的含药血清及DDP，于培养箱中继续培养24 h，0.25%胰酶消化，离心，用PBS液洗涤2次，制成细胞悬液，取200 μl，加bcl-2单抗工作液20 μl，另1支加阴性对照单抗IgG1-PE，避光反应20 min，上机检测。结果见表1。表1  不同浓度白花蛇舌草含药血清对PG细胞bcl-2基因表达的影响
        △表示与正常血清组比较差异显著（P<0.05）, △△表示与正常血清组比较差异极显著（P<0.01）；*表示与DDP组比较差异显著（P<0.05），**表示与DDP组比较差异极显著（P<0.01），n=5
        共分6组：1组10%正常血清组；2组5%白花蛇舌草含药血清组；3组10%白花蛇舌草含药血清组；4组15%白花蛇舌草含药血清组；5组1 μg/ml DDP+10%正常血清组；6组1 μg/ml DDP+10%含药血清组。
       3  讨论
        bcl-2是滤泡型B细胞淋巴瘤/白血病 2（B-cell lymphoma/leukemia-2，bcl-2)的缩写，人bcl-2基因是从与滤泡性淋巴瘤相关的t(14:18)染色体易位的断裂点克隆到的。在此易位中，bcl-2从其正常位点(18q21)易位到与位于14q32的免疫球蛋白重链(IgH)座位并列的位置,这导致在淋巴瘤细胞中该基因的转录启动以及26kb bcl-2蛋白的过度表达。bcl-2基因是一种细胞凋亡抑制基因，bcl-2基因蛋白定位于核膜皱褶处、内质网膜及线粒体膜上。bcl-2蛋白不阻止药物进入细胞,也不抑制药物引起的DNA损伤，但bcl-2蛋白具有保持细胞不死亡的抗凋亡作用［1～4］。在多种肿瘤组织中，由于它异常的高表达，可使肿瘤细胞群逃避和减少凋亡，造成增殖细胞群的细胞数量增多，这与肿瘤的恶性生物学行为和预后不良有密切关系。
        本实验采用流式细胞仪分析不同浓度白花蛇舌草含药血清对PG细胞bcl-2基因表达的影响，结果表明，不同浓度白花蛇舌草含药血清作用于肿瘤细胞后,可明显抑制bcl-2的高表达, 与正常血清组比较，具有非常显著性地差异（P<0.01），不同浓度的含药血清对PG细胞的作用存在明显的量效关系，随着浓度的增高，bcl-2基因表达率明显降低。而且白花蛇舌草含药血清与DDP合用组，与单用DDP组比较，有非常显著性地差异（P<0.01），说明白花蛇舌草含药血清与DDP合用可以明显增强DDP抑制肿瘤细胞bcl-2基因表达的作用。提示白花蛇舌草抑制肿瘤细胞内凋亡抑制基因bcl-2的表达，可能是其抗肿瘤作用的主要机制之一，影响其基因表达的因素还有待进一步研究。
       【参考文献】
         ［1］ 邵世滨,纪学师. Bcl-2基因在肿瘤组织中表达的研究进展［J］. 临沂医学专科学校学报,2004,26(2):145.
       
       ［2］ 臧运华,李 震,李 洁,等. 益气养阴方对K562细胞bcl2及p53基因表达的影响［J］.山东中医药大学学报,2004,28(3):234.
       
       ［3］ Roth W,Grimmel C,Rieger L,etal.Bag-1 and Bcl-2 gene transfer in malignant glioma : modulation of cell cycle regulation and apoptosis［J］.Brain Pathol,2000,10(2):223.
       
       ［4］ MV Blagosklonny. Unwinding the loop of Bcl-2 phosphorylation［J］.Leukemia, 2001,15:869.