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       【摘要】 
       目的优化大黄游离蒽醌的水解条件。方法通过单因素实验、Two-Level实验及响应面分析法，以水解率为考察指标，对反应温度、盐酸用量、时间及搅拌速度进行优化。结果优选的水解工艺条件为：5.4 mol/L盐酸，液体内部温度为46℃，搅拌速度控制在50～150 r/min，水解1.5 h。在最佳工艺条件下，水解率达到97%。结论实验结果为大黄水解工艺的改进提供了依据。
       【关键词】  大黄 游离蒽醌 水解 响应面法
        大黄是传统中药，为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatam L.，唐古特大黄R.tanguticum Maxin.ex Reg.及药用大黄R.officinale Baill.的根及根茎，性寒味苦，具泻热毒、破积滞、行淤血等功效［1］。研究表明，其主要有效成分游离蒽醌具有抗菌消炎、抗病毒、抗癌、保肝利胆、降脂降压、促智、抗衰老和延缓肾衰等作用［2，3］。
        大黄游离蒽醌苷元包括大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等，结合蒽醌大部分为葡萄糖苷［1］。大黄游离蒽醌一般采用从大黄中提取蒽醌类化合物再水解的方法制备。关于水解条件的研究报道不一，且不详尽，本文对大黄游离蒽醌水解条件进一步研究。
       1  仪器与材料
        R-200型旋转薄膜蒸发器（瑞士Büchi公司），MP502B型电子天平（上海精科仪器有限公司），METTLER AE240 分析天平（上海托利多-梅特勒仪器有限公司），HHS－1型电热 恒温水浴锅（上海浦东荣丰科学仪器有限公司），FW80型微型高速万能试样粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司），UV-2550紫外分光光度计（日本岛津制作所），101-1型不锈钢数显电热鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）。
        大黄素对照品（江苏淮安市巍伟植化研究所，批号20070602）；氯仿、氢氧化钠、氨水、盐酸（上海化学试剂公司，分析纯）；大黄药材　购自江苏镇江江扬国药有限公司，产地甘肃，批号20060615，经江苏大学欧阳臻教授鉴定为掌叶大黄。样品大黄捡选去杂，70℃烘干，中药粉碎机粉碎，过40目筛，筛下物密封保存备用。
       2  方法
        2.1  标准曲线测定 密称取105℃干燥至恒重的大黄素对照品3.8 mg，置25 ml量瓶中，用氯仿溶解稀释至刻度，摇匀，得对照品溶液。精密吸取该对照品溶液10 ml，置25 ml量瓶中，水浴蒸干后，加入5%NaOH-2%NH3·H2O混合碱液溶解稀释至刻度，精密吸取该液0.7，1，2，3，4，5 ml，分别置10 ml量瓶中，用混合碱液稀释至刻度，于524 nm波长处分别测定吸光度A值。以溶液浓度为横坐标，A值为纵坐标，计算回归方程为A=－0.009 1＋0.035 5 C，R=0.999 7。线性范围4.3～30.4 μg/ml。
        2.2  含量测定［4］  精密吸取待测液1 ml，置试管中，沸水浴加热蒸干，加蒸馏水1.0 ml，40%FeCl3溶液1.2 ml，沸水浴加热20 min，再加入盐酸0.5 ml，沸水浴加热30 min，不时振摇，使供试品溶液中结合态的蒽醌水解为游离态，冷却，以10 ml氯仿分2次萃取，合并氯仿层，用混合碱液萃取氯仿液，直到无色，合并混合碱液定容至10 ml，以混合碱液为空白，用紫外可见分光光度计在524 nm处测其吸光度A值，根据回归方程，计算单位待测液中以游离蒽醌量表示的总蒽醌的含量。
        精密吸取待测液1 ml，置试管中，沸水浴加热蒸干，加蒸馏水1.0 ml，余下同“2.2“项中“以10 ml氯仿分2次萃取……”，计算单位待测液中游离蒽醌的含量。
        2.3  单因素实验取一定量的大黄粉末，10倍量80%的乙醇提取3次，合并，浓缩至无醇味，定容。取等量大黄提取液，先后按照不同水解液温度、盐酸浓度、时间及搅拌速度进行单因素水解试验，按“2.2”方法测定水解后游离蒽醌含量，并按下式计算结合蒽醌的水解率。
        结合蒽醌水解率（%）=（水解后游离蒽醌含量－水解前游离蒽醌含量）/（水解前总蒽醌含量－水解前游离蒽醌含量）×100%
        2.4  主要因素的确定Two-Level实验根据单因素试验结果，采用SAS软件中的“Two-Level”设计，同“2.3”以水解率为指标，对以上四个因素进行主要因素的筛选。1取每个因素里面的最高响应值所对应的水平，-1则取每个因素里的最低相应值所对应的水平。表1  Two-Level实验因素水平
        2.5  Box-Behnken试验根据单因素试验及Two-Level试验结果，采用响应面Box-Behnken设计分析，同“2.3”以水解率为响应值，对主要3个因素（盐酸浓度、温度和时间）3水平进行优化，实验设计见表2。表2  响应面分析实验因素水平表
       3  结果
        3.1  单因素优化实验结果结果见图1～4。由图1可知，水解液温度条件在40℃时，水解率最高。而温度太高则可能引起游离蒽醌的降解，造成损失。
        文献报道［5］，水解酸浓度一般在3～6 mol/L，故盐酸浓度试验设计在该范围之间。由图2可知，盐酸浓度调节到4 mol/L时，更利于快速完成水解，并且能避免游离蒽醌发生降解。
        由图3可知，在1 h处的总游离蒽醌含量最高，即水解率达到最大。水解1 h以后，游离蒽醌含量开始下降，推测是由于长时间加热，盐酸大量挥发损失。也有文献报［6］道，结合蒽醌在发生水解的同时，游离蒽醌本身也发生降解反应或化学转化。故应该控制水解时间在2 h内，否则易造成不完全水解或者游离蒽醌的损失。
        由图4可知，搅拌能促进结合蒽醌与盐酸充分接触，并且使游离蒽醌不被杂质颗粒包裹而损失，但是转速过高易造成液体喷溅损失，故转速控制在50～150 r/min。
        3.2  主因素实验结果从F值的大小可以直观地看出（见表3），上面的4个因素中，对响应值—水解率（%）影响的显著性排列是C>B>A>D。且这3个因素的F值的置信度均在90%以上，所以选择C、B和A这3个因素作为主要因素进一步的响应面分析，以确定其对应的最优水平。表3  各因素的主要效应
        3.3  响应面法优化实验结果经回归拟合后，实验因子对响应值的影响可用回归方程表示：Y =-2.598 91＋1.540 94X1－0.081 97X2 ＋1.137 52X3 －0.564 36X12 ＋ 0.008 25X1X2 －0.546 55 X1 X3 －0.001 07X22 ＋ 0.009 14X2 X3－0.386 86X32 
        式中，Y为水解率的预测值，X1，X2，X3分别为盐酸浓度、温度和时间的真实值。
        由回归方程的方差分析（表4）可见，该回归模型极显著（P﹤0.01），且模型的决定系数R2=0.957 3，表明回归模型描述各因子与响应值之间的关系时，其因变量与全体自变量之间的线性关系是显著的，即试验方法是可靠的。各项的方差分析表明，一次项（P=0.023﹤0.05）、交互项（P=0.011﹤0.05）均显著，二次项（P=0.004﹤0.01）极显著影响。
        图5～6可见，温度和时间的交互作用不大，随着温度的升高，水解率开始下降；盐酸浓度和温度、时间的交互作用影响显著。根据预测值确定大黄游离蒽醌的最佳水解条件为5.4 mol/L盐酸，反应液温度为46℃，搅拌速度控制在50～150 r/min，水解1.5 h。表4  响应面法方差分析结果
        3.4  验证实验对大黄游离蒽醌的水解率和回归方程的合适性及有效性进行验证实验，结果分别为96.6 9%，97.31%，96.72%，96.96%，97.24%，97.27%。试验平均值为（97.03±0.28）%，与预测值97.7%接近，说明水解基本完全。
        表明通过响应面优化后得出的回归方程具有一定的实践指导意义。
       4  结论
        大黄游离蒽醌水解的最佳工艺条件：5.4 mol/L盐酸，液体内部温度为46℃，搅拌速度控制在50～150 r/min，水解1.5 h，水解率在97%左右。
        
       【参考文献】
         ［1］ 王筠默.中药研究与文献检索［M］.上海：上海远东出版社，1994：123.
       
       ［2］ 丁玉玲.大黄蒽醌类的研究概况［J］.时珍国医国药，2005，16（11）：1160.
       
       ［3］ 陈红斌，陈 钧.大黄对痤疮主要致病菌的体外抑菌作用研究［J］.中国药理与临床，2006，22(3，4)：111.
       
       ［4］ 黄 园，徐雄良，张志荣，等. 正交试验法研究水提与醇提对大黄蒽醌提取率的影响［J］.中成药, 2003, 25(4)：273.
       
       ［5］ 陈琼华，戴汉松，苏学良.中药大黄的综合研究［J］.天然产物研究与开发，2001，13（3）：58.
       
       ［6］ 苏子仁，曾元儿，周 华.大黄煎煮过程的化学变化初探［J］.中国中药杂志，1999，24（5）：291.