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       【摘要】 
       目的研究紫萍提取物是否具有保护内皮细胞免受过氧化氢损伤的作用。方法采用MTT比色法筛选紫萍提取物作用于内皮细胞的安全剂量，建立H2O2对内皮细胞的氧化损伤模型，并研究紫萍提取物的保护作用。最后采用检测试剂盒方法分析紫萍提取物作用后内皮细胞中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性变化。结果紫萍提取物的浓度<100 μg/ml，作用时间为24 h时，无明显细胞毒性。以1 mmol/L的H2O2作用于ECV-304细胞1 h造氧化损伤模型，10，25，50 μg/ml的紫萍提取物具有预防氧化损伤作用，可使细胞的存活率由21.98%分别上升至37.49%，51.71%和64.74%，其机理可能是紫萍提取物能够剂量依赖性的增强SOD，CAT和GSH-Px等酶的活性。但是紫萍提取物无治疗氧化损伤的作用。结论紫萍提取物可以有效保护内皮细胞免受氧化损伤。
       【关键词】  紫萍 氧化损伤 过氧化氢 超氧化物歧化酶 过氧化氢酶 谷胱甘肽过氧化物酶
       The Protective Effect of Spirodela polyrrhiza (L.) Schleid Extract on ECV-304 Injury Induced by Hydrogen Peroxide
        PENG Liang，  LI Zhimin
        （School of Pharmacology, Jiangxi Normal University of Science & Technology, Nanchang, Jiangxi 330013，China）
        Abstract：ObjectiveTo study the protective effect of Spirodela polyrrhiza(L.) Schleid extract (SE) against the damage caused by hydrogen peroxide (H2O2) in human vascular endothelial cells (ECV-304). MethodsNormal ECV-304 cells were respectively incubated with SE 5～400 μg/m for 24h-96h, or H2O2 0.125～10 mmol/L for 1～24 h, the survival rate of cells was determined by tetrazolium assay (MTT). To evaluate the protective effect of SE on ECV-304 injury induced by H2O2, ECV-304 was divided into control, model, and SE treatment groups. In SE treatment group, ECV-304 was incubated with SE 5～50 μg/ml for 24 h，before or after H2O2 1mmol/L (final concentration) was added to ECV-304 in the model group and the SE treatment group for 1 h. The survival conditions of ECV-304 were expressed by the OD values assessed by MTT assay. Furthermore, the activities of SOD, CAT and GSH-Px in ECV-304 cells treated with 10～50μg/ml SE were determined by the corresponding assay kits. Results5，10，25，50 μg/ml SE had no significant cytotoxicity on ECV-304 at 24 h，but 100 μg/ml , 200 μg/ml ,and 400μg/ml SE markedly decreased the survival rate at 24 h. The viability of ECV-304 was significantly inhibited by 1 mmol/L H2O2 at 1h. Pretreated with 10，25，50 μg/ml SE, the survival rate and the activities of SOD, CAT and GSH-Px in cells were increased in a concentration-dependent manner. But SE had no protection on ECV-304 injury induced by H2O2. ConclusionSE has dual effects on the survival rate of ECV-304 in vitro, which is related to the concentration. Pretreatment with 10～50 μg/ml SE can protect ECV-304 against H2O2 injury.
        Key words：Spirodela polyrrhiza(L.) Schleid；  Hydrogen peroxide；  SOD；  CAT；  GSH-Px
        血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)是介于血液与血管壁之间的屏障，在创伤修复、血管生成、止血、血栓形成、出血性疾病、动脉粥样硬化、糖尿病等一系列生理和病理过程中起着重要作用。一旦内皮细胞受到损伤，则会导致血管屏障功能的损害，从而引发动脉粥样硬化、高血压病等多种心血管疾病的发生。导致VEC受损的原因很多，生物体内各种氧化-还原反应产生的羟基自由基（·OH）、超氧阴离子（O-2·）、过氧化氢（H2O2）等自由基(Reactive oxygen species, ROS )的累积是其中之一［1～3］。血管内皮细胞功能性障碍的发生既可能是心脑血管疾病发病的始动环节，又可作为病情的观察指标和治疗学手段改进的突破口。因此，内皮细胞被认为是心、脑血管疾病基因治疗中最佳的靶细胞。选择血管内皮细胞作为研究的突破口既是可行的，亦符合未来发展方向，同时随着血管内皮细胞培养手段的成熟，内皮细胞为治疗心血管疾病药物的筛选和药理研究提供了新的实验材料，为在细胞水平进行心血管疾病相关药物的药理研究提供了可能。
        紫萍Spirodela polyrrhiza(L.) Schleid为浮萍科紫萍属植物的全草，辛、寒，入肺经，有祛风、发汗利尿、消肿、行水、清热、解毒的功效，中医用于治疗荨麻疹、急性肾炎等［4］。紫萍中除了含有蛋白质、β-胡萝卜素、脂类化合物等物质外，还含有芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、芹菜素-7-O-葡萄糖苷(apegenin-7-O-glucoside)和木犀草素-7-O-葡萄糖苷(leuteolin-7-O-glucoside) 等黄酮类化合物［5］。本研究拟以体外培养的人脐静脉内皮细胞（ECV-304）为研究材料，选用H2O2诱导ECV-304氧化损伤的模型，从ECV-304的存活率，细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）等酶活性变化等方面入手，研究紫萍提取物（SE）对ECV-304细胞的保护作用。旨在探讨该提取物是否具有减轻细胞氧化损伤的作用，从而为发现紫萍新的药理药效提供理论依据，同时也为探求开发紫萍资源的新途径奠定了基础。
       1  材料
        人脐静脉内皮细胞株ECV-304，购自中国科学院上海细胞生物研究所。
        紫萍提取物（SE）：由本实验室自制，经过乙醇溶液回流提取、旋转浓缩、壳聚糖絮凝除杂、大孔吸附树脂纯化、真空干燥等步骤后得到该提取物，经过分析后发现其中主要含有黄酮类化合物，其含量大于80％。SE溶解于DMSO中，配成母液，-20℃冰箱保存。实验前用培养液稀释到所需要的浓度（DMSO的终浓度<0.1%），0.22 μm的微孔过滤器过滤。
        RPMI-1640培养基、胎牛血清购自GIBCO公司；SOD，GSH-Px，CAT测定试剂盒均购自南京建成生物研究所；MTT购自Sigma公司。
       2  方法
        2.1  ECV-304的培养ECV-304培养于含10%的胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃的细胞培养箱中（5% CO2），待细胞铺满培养瓶80%～90%左右时，用0.25%胰酶＋0.02%EDTA的消化液进行传代培养。
        2.2  四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法MTT溶解于PBS中，配成5 mg/ml的溶液，0.22 μm的微孔滤膜过滤后避光保存，于一周内用完。在加入MTT前，吸弃培养板中各孔的培养液，PBS洗1～2次，然后加入新鲜培养液和10%的MTT，于细胞培养箱中培养4 h后，吸弃培养液，加入200 μl的DMSO，在振荡器上振荡10 min，待充分溶解后，于Model 550多孔酶标仪570 nm处检测吸光值。
        2.3  SE对ECV-304细胞的影响（4～5）×104个/ml密度的ECV-304细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μl。培养24 h后，吸弃培养液，加入含药培养液，SE的终浓度分别为5，10，25，50，100，200，400 μg/ml，另设对照组，常规培养。分别培养24，48，72，96 h后， 用MTT比色法检测各孔吸光值。
        2.4  H2O2对内皮细胞损伤实验（4～5）×104个/ml密度的ECV-304细胞接种于24孔培养板中，每孔1 000 μl。培养24 h后，吸弃培养液，加入新鲜培养液和H2O2，其终浓度分别为0.125，0.25，0.5，1，2 mmol/L。处理1，2，4 h和24 h后，用MTT比色法检测各孔吸光值。
        2.5  SE对H2O2损伤内皮细胞的保护作用（4～5）×104个/ml密度的ECV-304细胞接种于24孔培养板中，每孔1 000 μl。培养24 h后，吸弃培养液，后续实验分为两个方向进行。
        2.5.1  SE的预防作用实验分为对照组、损伤组和预防组。对照组细胞按常规方法培养，损伤组细胞用不含药培养液培养，其余的处理方法与对照组细胞相同。处理组细胞分别用终浓度为5，10，25，50 μg/ml 的SE预处理24 h后，吸弃培养液，PBS冲洗1～2次，加入H2O2终浓度为1 mmol/L的培养液，处理1 h后，MTT检测吸光值。
        2.5.2  SE的治疗作用实验分为对照组、损伤组和治疗组。对照组细胞按常规方法培养。损伤组和治疗组的细胞分别用H2O2终浓度为1 mmol/L的培养液，预先处理1 h，吸弃培养液，PBS冲洗1～2次。损伤组用不含药培养液培养，治疗组分别加入含药培养液，SE终浓度为5，10，25，50 μg/ml，处理24 h，用MTT法检测各孔吸光值。
        2.6  SOD，GSH-Px，CAT测定实验设对照组、损伤组和处理组。将等量ECV-304细胞接种于50 ml细胞培养瓶中，培养48 h后，吸弃培养液，对照组和损伤组加入新鲜的不含药培养液，常规培养。处理组加入含药培养液，STF终浓度分别为10，25，50 μg/ml。继续培养24 h后，损伤组用1 mmol/L的H2O2处理1 h。吸弃各实验组的培养液，PBS冲洗1～2次，消化液消化，用等量的PBS收集细胞。超声破碎仪破碎后，按照各个试剂盒的操作说明进行操作。
        2.7  数据处理以DPS统计软件对实验结果进行分析，数据均以±s表示。
       3  结果
        3.1  SE对ECV-304细胞的影响设对照组与实验组。对照组仅用培养液培养，试验组加入不用浓度的SE（5，10，25，50，100，200，400 μg/m），分别作用于ECV-304细胞24，48，72，96 h后，用MTT比色法测得的吸光值见表1。
        由表1可知，当SE的浓度<100 μg/ml时，在作用24 h时，对ECV-304基本无毒性，而随着作用时间的增加，毒性也随之增加。但到了第96小时，小剂量（≤50 μg/ml）的SE又不再显示毒性。因此在以后的实验中，SE的浓度选择5，10，25，50 μg/ml，作用时间为24 h。
        3.2  H2O2细胞损伤实验设对照组与实验组。对照组仅用培养液培养，实验组用不同浓度的H2O2（0.125，0.25，0.5，1，2，5，10 mmol/L）分别作用于ECV-3041，2，4，24 h后，用MTT比色法测得的吸光值见表2。由表2可知，不同浓度的H2O2对ECV-304均有不同程度的抑制作用，1 mmol/L的H2O2作用1 h后，细胞存活率仅为对照组的51.82%。而且当H2O2浓度≥1 mmol/L后，作用时间基本对实验结果无影响，所以为了节约试验时间，在以后的试验中，H2O2的浓度取1 mmol/L，作用时间为1 h。表1  不同浓度的SE对ECV-304细胞的影响表2  不同浓度的H2O2对ECV-304细胞的影响与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01；n=4
        3.3  SE对ECV-304细胞氧化损伤保护作用
        3.3.1  SE的预防作用实验分为对照组、损伤组和预防组。对照组只加入培养液，预防组用不同浓度的SE（5，10，25，50 μg/ml）处理ECV-304细胞24 h后，损伤组和预防组同时吸弃培养液，加入含1 mmol/L H2O2的培养液，孵育1 h后，用MTT法检测吸光值。实验结果见表3。从表3可以看出，SE在5 μg/ml的浓度时，对H2O2造成的氧化损伤并无保护作用，而当SE的浓度≥10μg/ml，则表现出明显的保护作用，而当SE的浓度≥10 μg/ml，则表现出明显的保护作用。与对照组相比，细胞存活率由未加SE保护的H2O2处理组（损伤组）的21.98%分别上升至37.49%，51.71%和64.74%。表3  SE对H2O2氧化损伤的预防作用
        3.3.2  SE的治疗作用实验分为对照组、损伤组和治疗组。对照组只加入培养液，损伤组和治疗组先用含1 mmol/L H2O2的培养液培养1 h，然后吸弃培养液，损伤组加入培养液，治疗组加入含SE（终浓度分别为5，10，25，50 μg/ml）的新鲜培养液，培养24 h后，用MTT比色法，检测吸光值，实验结果见表4。由表4可以看出，损伤组与治疗组间无显著性差异，说明SE对H2O2造成的氧化损伤无治疗作用。 表4  SE对H2O2氧化损伤治疗作用与损伤组比较，*P<0.05，**P<0.01
        3.4  SE对ECV-304细胞内SOD，CAT和GSH-Px活力的影响H2O2损伤组和SE处理组细胞内SOD，CAT和GSH-Px的活性变化见图1。
        图1  SE对ECV-304细胞内SOD，CAT和GSH-Px酶活力的影响
        从图1可以看出，H2O2损伤后，细胞内SOD，CAT和GSH-Px活力均有所下降，比对照组细胞分别降低了22.48％，20.96％和12.67％。而不同浓度的SE作用于ECV-304细胞24 h后，均能提高细胞内3种酶的活力。与对照组相比，50 μg/ml处理组细胞内的SOD，CAT和GSH-Px活力分别升高了85.12%, 158.94% 和94.5%。
       4  讨论
        H2O2是一种强氧化剂，可作为内皮细胞脂质过氧化反应的引发物，但是目前关于H2O2氧化损伤内皮细胞的剂量报道差别较大［6～8］。在本实验中发现，1 mmol/L浓度的H2O2可以明显抑制ECV-304细胞的增殖。而且，作用时间对实验结果的影响不显著。
        在预实验中发现，100 μg/ml 的SE与1 mmol/L 的H2O2混合放置24 h后，SE的黄酮含量下降了14.69%，说明SE与H2O2会发生反应，因此H2O2与SE不能同时加入。在研究SE的抗氧化活性试验中，主要研究了SE的预防作用与治疗作用。实验结果证明，SE的浓度>5 μg/ml时，可以有效地预防H2O2氧化损伤，提高ECV-304细胞的存活率。但是对H2O2氧化损伤后的细胞，则无治疗作用。
        机体防御体系的抗氧化能力的高低与健康存在着密切的联系，当人体抗氧化能力降低时，易引起炎症、肿瘤、糖尿病和免疫系统等疾病。该防御体系有酶促及非酶促反应两部分，它们的作用主要是分解自由基和活性氧，分解过氧化物，除去起催化作用的金属离子。酶促反应部分主要是SOD，CAT和GSH-Px等与氧化-还原反应相关的酶，SOD能够使机体内产生的超氧阴离子自由基发生歧化，生成过氧化氢酶，过氧化氢再被CAT和GSH-Px分解，这些酶活力的高低间接反应了细胞或机体清除氧自由基的能力。试验结果表明，H2O2损伤组的细胞内SOD，CAT和GSH-Px与对照组相比，都有所下降，说明H2O2处理细胞后，降低了细胞的抗氧化能力，导致细胞内自由基的增多，从而抑制ECV-304细胞的增殖。10，25 μg/ml和50 μg/ml的SE处理ECV-304细胞24 h后，可以明显的增强细胞内的SOD，CAT和GSH-Px的活力。这些结果提示，SE可能是通过增强细胞清除自由基的能力来保护ECV-304细胞免受H2O2诱发的氧化损伤。
        
       【参考文献】
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