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       【关键词】  连翘；,,乌索酸；,,齐墩果酸；,,高效液相色谱
       摘要：目的建立同时测定连翘中乌索酸和齐墩果酸含量的测定方法。方法采用高效液相色谱（HPLC）法测定其含量。色谱柱为NovaPak C18(3.9 mm×300 mm，4 μm)，流动相为甲醇水(88∶12)，流速0.8 ml/min，检测波长210 nm，柱温25℃。结果乌索酸和齐墩果酸分别在0.912~4.560 μg（r=0.999 8）和0.312~1.560 μg（r=0.999 6）范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系；乌索酸和齐墩果酸的平均回收率分别为98.2 % (RSD=1.1 %)和97.8 % (RSD=1.4 %)。结论 此法简单、方便、快速、准确，可为中药连翘质量评价和控制提供科学依据。
       关键词：连翘；  乌索酸；  齐墩果酸；  高效液相色谱
       HPLC Determination of the Contents of Ursolic Acid and Oleanolic Acid in Forsthia suspense ( Thunb. )Vahl
       ZOU Shengqin， YU Jihai， GAO Xinghua， CHEN Wu
       （Bioengineering Institute of Yichun College，Yichun， Jiangxi 336000，China; School of Sciences, Yichun College Yichun， Jiangxi 336000，China; Department of Bioengineering, Yichun College,Yichun,336000, China）
       Abstract：ObjectiveTo develop a method for the quantitative analysis of ursolic acid and oleanolic acid in Forsythia suspense simultaneously.MethodsHPLC was carried out on the NovaPak C18 column (3.9 mm×300 mm, 4 μm) at 25℃ using MeOHH2O(88∶12) as mobile phase with a flow rate of 0.8 μl and detection wavelength was set at 210 nm .ResultsThere was good linear relationship between the peak area and the sample content injected at the ranges of 0.912~4.560μg（r=0.999 8）and 0.312~1.560 μg（r=0.9996）for ursolic acid and oleanolic acid respectively .The average recovery rate of ursolic acid and oleanolic acid were 98.2 % (RSD 1.1 %)and 97.8 % (RSD 1.4 %),respectively. ConclusionIt"s a simple, convenient, quick and accurate method, and can also be used scientifically in the quality estimation and control of Chinese traditional medicine Forsythia Suspense.
       Key words：Forsythia suspense (Thunb.)Vahl;   Ursolic acid;   Oleanolic acid ;   HPLC
   
　　连翘Fructus Forsythiae为木犀科连翘属植物连翘Forsythia suspense(Thunb.)Vahl的干燥果实, 别名旱连子、大翘子、空壳、连召、落翘。始载于《神农本草经》，性平气微香味微苦，具有清热解毒，疏散风热，消痈散结、强心利尿和降血压之功效，为疮家圣药。主产于我国东北、华北、长江流域至云南等地，其中以山西晋南，河南豫西所产不但色泽鲜亮且质量佳，为道地药材。连翘是我国常用的大宗药材，主要含有连翘酚(forsythol)、连翘苷(Phillyrin)、连翘苷元(phillygenin)；齐墩果酸(oleanolic acid，OLA)、白桦脂酸(betulinic acid)、乌索酸(ursolic acid，UA)、松脂素(pinoresinol)、甾醇化合物、马苔树脂醇苷（matairesinoside）和多种烃类、醛酮类、醇酯醚类挥发性成分 ［1~3］。现代药理研究表明，连翘具有广谱抗菌、抗病毒等作用，对丹毒、颈淋巴结结核、尿路感染、扁桃体炎、肾炎双球菌等均有抑制作用［4~6］，常用于急性胃炎，呼吸道感染等病症。本实验采用乙醇超声提取，建立HPLC法同时测定了连翘中乌索酸和齐墩果酸的含量，该法简单快速，灵敏准确，重现性好，为控制连翘的内在质量提供了科学依据。
       　　1  仪器、材料与试剂
       1.1  仪器 Waters515双泵型高效液相色谱仪，2996光电二极管矩阵检测器，色谱柱NovaPak C18柱(3.9 mm×300 mm，4 μm)，7725I 进样阀，Empower 中文色谱工作站，ROMB10D高纯水机（杭州永洁达膜分离设备厂），FC204分析天平（上海天平分析仪器厂），FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司），20226A型数显电热恒温干燥箱（上海阳光实验仪器有限公司），KS1500超声提取仪器（宁波科盛仪器厂）。
       1.2  材料与试剂甲醇为色谱纯（上海陆忠试剂厂），水为高纯水，乙醇为分析纯（95％，江西同盟试剂化工厂），乌索酸和齐墩果酸对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号110742200314、110792200304， 供含量测定用）。连翘(市售，购自宜春市开心大药房)，经宜春学院陈武研究员鉴定为木犀科植物连翘Forsythia Suspense(Thunb.)Vahl的干燥果实。
       　　2  方法与结果
       2.1  色谱条件色谱柱为NovaPakC18（3.9 mm×300 mm，4 μm)；流动相为甲醇水（88∶12，V/V）；流速为0.8 ml/min；检测波长为210 nm；柱温为 25°C，进样量 15μl。乌索酸和齐墩果酸理论塔板数均大于9 000，对照品混合溶液及连翘样品溶液的HPLC色谱图见图1。
       2.2  溶液的制备
       2.2.1  混合对照品溶液的配制 精密称取干燥至恒重的乌索酸和齐墩果酸对照品22.8 mg和7.8 mg，混合至10 ml容量瓶中，溶解定容。精密量取1 ml置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为乌索酸、齐墩果酸对照品混合溶液。
       图1  对照品和连翘样品的HPLC色谱图（略）
       2.2.2  样品溶液的制备取连翘样品于80℃恒温干燥10 h，粉碎，精密称取约4 g，加入95%乙醇溶液40 ml，超声提取120 min，冷却至室温，滤过，滤渣用乙醇超声洗涤2次，合并过滤液于50 ml容量瓶，乙醇定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，得样品溶液。
       2.3  线性关系实验精密吸取对照品混合溶液4，8，12，16，20 μl，按2.1色谱条件进样并测定峰面积。以峰面积对进样量进行线性回归，乌索酸和齐墩果酸的回归方程分别为：YUA=5.78×105X+1.35×103，r=0.999 8，YOLA=6.32×105X-5.90×103，r=0.999 6。表明乌索酸进样量在0.912~4.560 μg，齐墩果酸进样量在0.312 ~1.560 μg时，线性关系良好。
       2.4  色谱进样精密度实验精密吸取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液15 μl进样，重复5次，测得乌索酸峰面积相对标准偏差（RSD）为0.6 %（n=5），齐墩果酸的峰面积相对标准偏差为0.9 %（n=5），表明仪器精密度良好。
       2.5  方法重现性实验精密称取连翘样品5份，按2.2.2项制备样品溶液，在2.1色谱条件下，精密吸取15μl进样分析，测乌索酸峰面积的相对标准偏差为1.1 %（n=5），齐墩果酸峰面积的相对标准偏差为1.9 %(n=5)，方法重现性好。
       2.6  加样回收率实验精密称取已知乌索酸和齐墩果酸含量并干燥至恒重的药材5份，分别加入适量的乌索酸和齐墩果酸对照品，按2.2.2项制备样品溶液，进样分析，乌索酸和齐墩果酸平均回收率结果见表1~2。
       表1  乌索酸加样回收率实验结果（略）
       2.7  样品中乌索酸和齐墩果酸含量测定结果精密称取连翘样品约4 g，制备样品溶液。精密吸取样品溶液10 μl，分别进样，平行实验5次，测定乌索酸和齐墩果酸峰面积，外标法计算含量。结果见表3。
       表2  齐墩果酸加样回收率实验结果（略）
       表3  样品中乌索酸和齐墩果酸的测定结果（略）
       　　3   讨论
       3.1  样品提取方法的选择原药中乌索酸和齐墩果酸的提取多采用乙醇回流法、索氏提取法，提取时间长，原料和试剂的使用量大，成本高，且溶剂易挥发污染环境。本实验尝试采用超声提取法，实验结果表明该法样品处理过程简单，提取率高，与传统的样品预处理方法相比，具有快速、环保、高效等优点。
       3.2  检测波长的确定取乌索酸和齐墩果酸对照品混合溶液进样，在190～500 nm波长范围进行光谱扫描，其最大吸收波长均为202.2 nm (图2)，但由于流动相在短波长处有末端吸收，为了减少干扰，提高信噪比，提取不同波长的色谱图进行比较，选择210 nm为检测波长信噪比高，峰形好，干扰小。
       图2  乌索酸和齐墩果酸对照品的紫外吸收光谱（略）
       3.3  不同采收期连翘中UA和OLA的含量对不同采收期连翘中乌索酸和齐墩果酸的含量检测分析表明，老翘中两组分的含量明显高于青翘和熟翘，采收期对中药连翘中乌索酸和齐墩果酸的含量影响较大。连翘中乌索酸和齐墩果酸的含量均较高，是连翘的主要活性成分，为保证药材的质量，应在连翘完全成熟后采收老翘为最佳。
       3.4  含量测定方法的建立  采用HPLC法，以外标法同时测定连翘中乌索酸和齐墩果酸的含量，方法准确，快速，灵敏，重现性好，可用于连翘的质量评价和控制。
       参考文献：
       ［1］  李英霞，孟庆梅．连翘的本草考证［J］.中药材，2002，25(6)：435.
       ［2］  张海燕．连翘化学成分及药理活性的研究进展［J］.中药材，2000，23(10):657.
       ［3］  陈玉俊，项  进，许美娟，等．连翘化学成分的研究［J］.中国中药杂志，1999，24(5):296.
       ［4］  田丽婷，马  龙，堵年生．齐墩果酸的药理作用研究概况［J］.中国中药杂志，2002，27(12):884.
       ［5］  Jie Liu．Pharmacoloy of oleanolic acid and ursolic acid［J］.Journal of Ethnopharmacology,1995,49:57.
       ［6］  Jie Liu．Oleanolic acid and ursolic acid research perspectives［J］.Journal of Ethnopharmacology,2005,100:92.
       基金项目：国家“863”计划重点资助项目（No.2002AA2Z3217）
       (宜春学院生物工程研究所・江西省天然药物活性成分研究重点实验室，江西  宜春  336000；宜春学院理学院，江西 宜春  336000；宜春学院生物制药2002级1班，江西 宜春  336000）