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       【关键词】  肺气肿胶囊；,,高效液相色谱法；,,槲皮素；,,山柰素
       摘要：目的建立肺气肿胶囊中槲皮素和山柰素含量测定方法 。方法采用高效液相色谱法，使用C18柱，流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40），检测波长为370 nm，流速为0.6 ml/min。结果槲皮素和山柰素分别在0.008~0.06 μg和0.006 88~0.0516 μg范围内呈良好线性关系，平均回收率分别为97.34%和97.72%，RSD分别为2.4%和1.3%（n=5）结论该方法灵敏准确，重现性好，专属性强，可作为肺气肿胶囊的质量控制。
       关键词：肺气肿胶囊；  高效液相色谱法；  槲皮素；  山柰素
       Determination of Quercetin and Kaempferol in Feiqizhong Capsules
       YUAN Bin ,  OUYANG Zhen, MIAO Yadong, JIANG Taotao, SHEN Jiangying
       (College of Biological and Engineering of Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu 212013, China)
       Abstract：ObjectiveTo establish a method to determine the content of quercetin and kaempferol in Feiqizhong Capsules.MethodsHPLC was used to determine the content of quercetin and kaempferol with detection wavelength at 370nm. The mobile phase consists of a mixture of methanol-0.4%H3PO4(60∶40). The flow rate was 0.6ml/min. ResultsThe linear regression for quercetin and kaempferol was obtained at the range of 0.008~0.006μg and 0.006 88~0.051 6 μg. The average recovery of quercetin and kaempferol were 97.34% and 97.72%, RSD were 1.3% and 1.7% respectively(n=5). ConclusionThe method is sensitive, accurate, reproducible and exclusive. It can be used for quality control of Feiqizhong Capsules.
       Key words：Feiqizhong Capsules；  HPLC；  Quercetin；  Kaempferol
   
　　肺气肿胶囊是由野马追等药材经过科学提取并加入适量辅料而制成的硬胶囊，具有补肾益气、活血化瘀、止咳祛痰的功效，主要用于治疗肺肾亏虚，血行不畅，痰浊阻肺所引起的胸闷憋气，动辄喘乏，咳嗽痰多，慢性气管炎，阻塞性肺气肿等证候。其治疗肺气肿的主要有效成分为黄酮类化合物，文献［1］报道黄酮类化合物具有降低血管脆性及异常通透性，能够扩张血管和降低血脂与胆固醇的作用，抑制血栓形成，同时还具有止咳、祛痰平喘的作用。为控制其质量采用测定水解苷类后的槲皮素和山柰素的含量。文献［2］报道槲皮素和山柰素的含量测定方法有紫外-可见分光光度法、荧光光度法、薄层扫描法等。本实验采用高效液相测定水解后的槲皮素和山柰素的含量为其质量控制的指标。
       　　1  仪器与材料
       1.1  仪器AG 135型电子天平（瑞士梅特勒）；Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996 DAD检测器；Empower工作站；SK250 LH超声波清洗器（上海科导超生仪器有限公司）。
       1.2  试剂与样品槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号081-9003），山柰素对照品（中国药品生物制品检定所，批号0861-200002）；甲醇（色谱纯），超纯水；盐酸，磷酸均为分析纯；肺气肿胶囊（江苏707制药公司，批号050306，050307，050308，050309，050402）。
       　　2  方法与结果
       2.1  色谱条件 Kromasil-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸（60：40）；流速：0.6 ml/min；柱温：30℃； 检测波长：370 nm；进样量：10 μl。在上述色谱条件下，样品中指标成分均能达到基线分离。槲皮素峰保留时间为12.3 min，山柰素峰保留时间为17.4 min。理论塔板数以槲皮素峰计算为3 000。
       2.2   对照品溶液的配制精密称取经五氧化二磷减压干燥24 h的槲皮素对照品和山柰素对照品适量，加甲醇制成浓度分别为4和3.44 μg/ml的对照品混合溶液。
       2.3   供试品溶液的制备取本品装量差异下的内容物，研细，混匀，精密称取1 g, 置具塞锥形瓶中，加三氯甲烷30 ml超声处理40 min，滤过，弃去三氯甲烷液，药渣挥干，再精密加入80%甲醇50 ml，密塞，称定重量，超声处理30 min，取出，放冷，称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，滤过，精密吸取续滤液25 ml，加20%盐酸5 ml，水浴回流30 min，取出，迅速冷却，用流动相定容至50 ml量瓶中，摇匀，取样，用滤膜（0.45 μm）滤过，即得。
       2.4   线性关系考察精密吸取2.2项下的对照品溶液2，4，6，8，10，12，15 μl，注入液相色谱仪，测定。以进样量 C为横坐标，以峰面积 A为纵坐标，进行线性回归处理，得回归曲线：槲皮素：A=6 101 400 C-9 103.3 ( r=0.999 2)；山柰素： A=6 835 900 C-12 408 ( r=0.999 4)，结果槲皮素和山柰素线性范围分别为0.008～0.06 μg和0.006 88～0.051 6 μg。
       2.5   精密度实验精密吸取同一对照品溶液10 μl，连续进样5次，峰面积 RSD值为1.74%，表明精密度良好。
       2.6   稳定性实验取供试品溶液，每隔2 h进样10 μl，共测定5次，第6次在12 h测定,测定其峰面积。计算结果峰面积 RSD值为1.11%,结果表明样品在12 h内稳定。
       2.7    加样回收实验取已知含量的肺气肿胶囊（批号050309）粉末0.5 g，共5份，精密称定，各精密加入0.02 mg/ml槲皮素对照品溶液6 ml和0.034 4 mg/ml山柰素对照品溶液2 ml，按2.3项下制备供试品溶液，测定。结果见表1。
       表1  回收实验结果（略）
       2.8    样品测定取不同时期的产品，照上述2.3项方法制备供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定。色谱图见图1。计算样品中槲皮素和山柰素的总量。结果见表2。
       a.对照品（1.槲皮素  2.山柰素）  b.样品
       图1  液相色谱数据（略）
       表2  样品含量测定结果（略）
       　　3  小结
       3.1    野马追为方中君药，具有清肺止咳、祛痰平喘、降血压的功效，但作者未见有文献对其基础研究报道，缺乏对其化学成分较系统的研究，其药理研究仅局限于全草提取物，因此野马追中缺乏能够直接测定的有效成分或指标成分，或含量太低。文献［3，4］报道野马追的有效成分多以槲皮素、山柰素、芦丁、金丝桃苷等黄酮醇和黄酮醇苷类物质形式存在。为建立肺气肿胶囊的质量控制指标，其含量测定应采用测定君药的有效成分，通过查阅文献，决定采用测定样品水解后的槲皮素和山柰素的总含量做为其质量控制指标。
       3.2    曾考察样品不经预处理所得到的色谱峰杂质多，干扰严重，目标峰达不到基线分离，参考文献［5］决定对样品先用三氯甲烷超声处理进行脱脂，再进行提取和水解步骤，所得样品杂质少，可降低对色谱柱的污染。比较了不同甲醇的提取效果［6，7］，结果80%甲醇提取效果最高，且杂质少，因此选择80%甲醇作为提取溶剂。同时比较了加热提取和超声提取的提取效率，结果表明超声效果优于加热回流提取，故采用超声提取。酸度和水解时间对水解结果有重要影响，参考文献［6，8］比较了不同加酸量和水解时间的影响，结果表明加入20%盐酸5 ml水解30 min即可水解完全。
       3.3   色谱条件的选择
       3.3.1   检测波长的选择取槲皮素和山柰素对照品溶液（甲醇为溶剂）在紫外分光光度计下于200~500 nm下进行扫描，结果表明槲皮素和山柰素在370 nm附近有最大紫外吸收。选择370 nm为检测波长时，杂质吸收峰小，目标峰形较对称， 且与相邻峰分离较好，故选用370 nm为检测波长。
       3.3.2    流动相的选择［5，6，8］本实验比较了50%，55%，60%的甲醇-0.4%磷酸水溶液体系的洗脱分离效果，实验结果表明3种流动相的分离效果相差不大，目标成分均能达到基线分离，分离度大于1.5，但低浓度甲醇洗脱时，指标成分保留时间长，较费时，采用高浓度甲醇洗脱时，指标成分保留时间适宜，且样品分离效果好，故采用60%甲醇水溶液为流动相。采用甲醇水溶液为流动相时，槲皮素和山柰素有拖尾现象，这是由于黄酮苷元的酚羟基产生电离，在固定相表面产生双保留机制。流动相中加适量酸可以抑制酚羟基的电离效应，使槲皮素和山柰素成为中性分子而在固定相上形成疏水缔合的保留机制，从而消除拖尾现象，使槲皮素和山柰素吸收峰对称，且与相邻峰达到基线分离，并可以缩短分离时间。比较了0.2%与0.4%磷酸水溶液的抑制效果，结果表明0.4%磷酸溶液可以有效抑制指标成分的拖尾现象。综合考虑，采用甲醇-0.4%磷酸（60∶40）为流动相时，槲皮素和山柰素与相邻峰的分离度为1.5，分离较好，故选用甲醇-0.4%磷酸（60∶40）为流动相体系。
       　　参考文献：
       ［1］  姚新生. 天然药物化学［M］. 北京:人民卫生出版社 2001： 172.
       ［2］  鲍廷铮，王庆伦，廖志辉. 槲皮素的研究近况［J］. 江西中医学院学报，1998 ，10(2):90.
       ［3］  肖晶，王刚力，魏  锋，等. 野马追化学成分的研究［J］.中草药，2004 35(8):855.
       ［4］  钱士辉，杨念云，段金廒，等. 野马追中黄酮类成分的研究［J］.  中国中药杂志，2004 ，29(1):50.
       ［5］  郭宗华，张  沛，李明炬，等. 银丹心泰滴丸的定性定量检测［J］.  中国药业，2003 ，12 (10):32.
       ［6］  孟宪生，沙  明，曹爱民，等. HPLC法测定莲须中槲皮素和山柰酚的含量［J］. 中成药，2003 25(12):1004.
       ［7］  杜海燕，郑志刚，李  婷，等. RP-HPLC法同时测定蜂胶中槲皮素和山柰酚的含量［J］.中草药，2002 ，33(11):997.
       ［8］  邓丹丹，赵浩如，黄罗生. 水解时间对黄酮含量的影响［J］.中成药，2004 ，26(8):662.
       (江苏大学生物与环境工程学院， 江苏 镇江  212013)