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       【摘要】 
       目的研究藏药朗庆阿塔治疗四氯化碳致大鼠肝纤维化的药效作用及机理。方法建立CCl4 诱导的化学性肝纤维化模型，观察藏药朗庆阿塔对肝纤维化大鼠血清的ALT，AST，ALP，TBil，LN，HA，CⅣ，PⅢNP及对大鼠肝脏指数、羟脯氨酸（Hyp）含量和肝脏病理学变化的影响。结果朗庆阿塔给药（2.85，5.7，11.4g生药/kg，ig）均显著降低模型大鼠的血清ALT，AST，ALP活性,减少血清中HA，PⅢNP和肝组织中Hyp的含量，明显改善肝脏组织的病理性损伤。结论 藏药朗庆阿塔对CCl4致大鼠肝纤维化有明显治疗作用。
       【关键词】  肝纤维化 朗庆阿塔 四氯化碳
       藏药朗庆阿塔系我国西藏自治区的藏医经典验方，由牛黄、西红花等13味药加工制成，已有五百八十多年的用药历史，是治疗肝硬化、肝腹水的特效藏药，主要功能为清热解毒、舒肝利胆、止血，用于肝硬化及肝硬化（腹水）引起的乏力，纳差，消化不良，右上腹胀闷不适，恶心等症。本文通过考察朗庆阿塔对CCl4引起的肝纤维化动物的相关指标的影响，研究朗庆阿塔对实验性肝纤维化大鼠的治疗作用，为其进一步的临床应用提供实验依据。
       1  材料与仪器
       1.1  动物SD大鼠140只，清洁级，♀♂各半，体重150～180g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2007-0005；动物饲养环境：SPF级，合格证号：SYXK(苏)2007-0026。
       1.2   药物与试剂朗庆阿塔(浸膏)，含生药2.3672g/ml，由江苏省中医药研究院制剂室提供，批号：070706。鳖甲软肝片：0.5g×48片， 内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司，批号：20070516。四氯化碳（分析纯），上海久亿化学试剂有限公司产品，批号：20060720。羟脯氨酸测试盒，由南京建成生物工程研究所提供，批号：071208。层粘连蛋白（LN）、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原（CIV）和Ⅲ型前胶原氨端肽(PⅢNP)放免分析药盒，北京北方生物技术研究所生产，批号：071120。
       1.3  仪器SN-695B型智能放免γ测量仪，上海原子核研究所日环仪器一厂生产；日立7060型全自动生化分析仪，日本进口；752s型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司生产；PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪，常州市中威电子仪器厂。
       2  方法［1，2］
       2.1  肝纤维化大鼠模型的建立取10只大鼠(♀♂各半)作为正常对照组，其余130只大鼠以15％四氯化碳溶液（将分析纯四氯化碳溶于植物油中，配成150 ml/L溶液备用）按1 ml/100 g体重灌胃，2次/周，连续7周。正常对照组同法灌胃给予等容积的溶剂植物油。造模7周时，随机取2只模型大鼠，处死后解剖取肝脏做病理组织学检查，观察是否已造成肝纤维化模型。其余模型大鼠禁食后，眼眶静脉丛采血，全自动生化分析仪测定血清ALT及AST水平。
       2.2  分组及给药方法将上述模型大鼠依据ALT及AST水平和体重、性别随机分为5组，即模型组（30只，♀♂各半）；阳性药组（0.55g/kg），藏药低、中、高剂量组（2.85，5.7，11.4g生药/kg）。每组20只，♀♂各半。按剂量灌胃给药1次/d，给药量均为10 ml/kg，正常组和模型组则灌胃等容积的蒸馏水。每周复称体重1次，按体重相应调整给药量，连续给药10周。
       2.3  观察指标  末次给药后，禁食(不禁水)12 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血5 ml，分离血清。
       2.3.1  血清学指标 ALT ，AST，ALP，T-Bil，TP，ALB用全自动生化分析仪检测。血清LN，HA，CIV，PⅢNP用放免法检测。
       2.3.2  肝组织羟脯氨酸（Hyp）测定按测试盒说明操作。
       2.3.3  病理组织学检查取完整肝脏，称重，计算脏器系数。取相同部位肝组织用中性甲醛固定，乙醇逐级脱水，常规石蜡包埋，HE染色，观察肝脏的病理组织学改变。并采用Masson染色及VG染色观察肝组织内纤维化程度。
       
       肝纤维组织增生的病理学分及标准：
       
       肝组织正常（-）；
       
       胶原纤维含量增加，很少形成条索分隔肝小叶，可见汇管区扙大，纤维化（+）；
       
       胶原纤维呈条索状分隔肝小叶散在分布，表现为不完全分隔假小叶（++）；
       
       胶原纤维呈较宽的铁丝索状分隔肝小叶，表现为完全分隔成假小叶（+++）；
       
       肝细胞脂肪变性病理学分级标准。
       
       肝细胞内未见空泡变性（-）；部分肝细胞（＜25％）内出现空泡（+）；较多的肝细胞（25％～50％）内出现空泡（++）；大量肝细胞（＞50％）内出现空泡（+++）。
       2.4  统计学处理病理组织学检查结果采用Ridit分析方法，其他数据均以  ±s表示，采用组间t检验统计学方法分析测试结果。
       3  结果
       3.1  动物一般情况正常组大鼠生长良好，体重自然增长，行走正常，活动敏捷，食欲正常，毛发整齐，大便成形。大鼠造模后，烦躁不安，大便溏稀，自造模第3周开始有脱毛现象，第5周开始出现腹部肿大，疑是腹水。停止造模后，各组大鼠体重开始缓慢增加，烦躁不安情绪消除，安静，嗜睡，大便逐渐正常，模型动物长出新毛。
       3.2   大鼠肝脏形态正常组大鼠肝脏颜色鲜褐红色，表面光滑，边缘锐利，质地较软。7周时，模型组大鼠肝脏左叶肿大，边缘钝，质地硬，左叶颜色较浅，部分呈泥沙样土黄色，但边缘尚好，肝脏与周围器官有粘连。
       3.3  藏药朗庆阿塔对大鼠体重、肝脏系数及羟脯氨酸的影响见表1。与正常组相比，模型组大鼠的肝脏系数与肝组织羟脯氨酸含量明显升高（P<0.01），体重也有降低的趋势(但无统计学差异)，表明大鼠肝纤维化模型基本形成。朗庆阿塔高、中剂量组和阳性组大鼠的脏器系数比模型组显著减少（P<0.05～0.01），高、中、低剂量组及阳性药组的羟脯氨酸含量均显著下降（P<0.05～0.01）。
       表1  藏药朗庆阿塔对大鼠体重、肝脏系数及羟脯氨酸的影响（略）
       与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；n=10
       3.4  藏药朗庆阿塔对肝纤维化大鼠肝功能的影响见表2。与正常组相比，模型组大鼠的血清ALT，AST，T-BIL，ALP水平显著升高（P<0.05～0.001），而TP和GLB水平有明显下降(P<0.05～0.01)，ALB水平也有一定幅度的下降，但无统计学差异(P>0.05)。朗庆阿塔高、中、低剂量和阳性药均能显著降低模型大鼠的ALT和AST水平（P<0.05～0.001），并使TP、GLB和ALB恢复接近正常水平。
       3.5  藏药朗庆阿塔对肝纤维化血清指标的影响  见表3。结果显示，造模后大鼠的血清HA、PⅢNP明显升高(P<0.05～0.01)，而LN和CIV水平变化不明显(P>0.05)。阳性药和朗庆阿塔高、中、低剂量均能显著降低模型大鼠的血清HA和PⅢNP水平（P<0.05～0.001）。
       表2  藏药朗庆阿塔对肝纤维化大鼠肝功能的影响（略）
       与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
       表3  藏药朗庆阿塔对肝纤维化相关检测指标的影响（略）
       与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
       3.6  藏药朗庆阿塔对肝纤维化大鼠肝脏病理组织形态学的影响见图1，表4～5。正常组HE染色显示肝小叶结构存在，肝板排列整齐，以中央静脉为中心向周围放射状排列。模型组肝内见多灶性点片状坏死伴炎细胞浸润，枯否细胞增生明显，肝间质内见胶原纤维增生，将肝细胞分隔成圆形或类圆形的假小叶结构，而且Masson染色及VG染色见肝组织内大量增生的胶原纤维，呈网状分布。朗庆阿塔给药高剂量组有2例纤维化正常，7例肝细胞轻度异性，Masson染色及VG染色，肝间质内胶原纤维增生情况有明显改善。
       图1  大鼠肝组织形态学照片（略）
       
       经Ridit分析方法可知，朗庆阿塔（高、中、低剂量组）和阳性药组对肝纤维组织增生、肝细胞脂肪变与模型组相比有显著性差异（P<0.05），说明朗庆阿塔具有明显的抗肝纤维化作用。
       表4  藏药朗庆阿塔对肝纤维组织增生的影响（略）
       表5  藏药朗庆阿塔对肝细胞脂肪变的影响（略）
       4  讨论
          
       肝纤维化已成为一个危害人类生命健康的世界性问题，如果能阻止其发生，肝硬化及其并发症就能得到有效控制。美国肝病学会第3次肝纤维化专题会议的召开，预示着“创伤愈合整合反应”新时代的出现。肝纤维化的可逆性早已被大家认可，现在有部分学者发现有些肝硬化一样是可以被逆转的［3］。
       
       肝纤维化的基本特征是细胞外基质(ECM )产生和降解不平衡导致间质胶原及其它基质成分积聚。目前的研究证实肝星状细胞(HSCs)的激活是肝纤维化发生的中心环节。过去20年的肝纤维化研究已经揭示出许多潜在、新颖的治疗靶标。去除潜在的致病因素被认为是治疗这类疾病的最有效的方法。许多致病因子都会导致肝纤维化，包括乙肝、丙肝病毒感染、饮酒、自身免疫性疾病、化学性损伤等。各种致病因子通过不同方式和途径作用于肝脏中的HSCs以及纤维形成细胞，导致其生物学及功能变化，引起肝纤维化。
       
       迄今已有的具有实验室苗头的药物、生物制剂或基因治疗研究主要是阻断单一纤维化通路或某一相关因素，其抗纤维化效果尚不尽人意。长期临床实践证明藏药朗庆阿塔治疗肝硬化疗效显著，其特点可能与具有多途径阻断肝纤维化的潜在作用及优势相关。
       
       藏医认为，隆、赤巴、培根是解释和分辨人体生理变化的三大因素。三因素不是一种具体的物质，而是某种共同属性的集中体现，是维持人体正常生命活动的基本物质基础，也是导致病患产生的内在因素。其中隆具有糙、轻、凉、细、硬、浮6种特点；赤巴具有润、锐、热、轻、嗅、泻、湿7种特点；培根具有润、寒、重、钝、柔、稳、粘7种特点。在正常生理状态下，三因素之间相互依存，相互制约，保持着相互协调和平衡状态，使生命处于有序的代谢状态，维持着人体的正常生理运行。在内外环境因素发生变化及各种致病因素的影响下，三因素的任何一方出现偏盛、偏衰、紊乱，都能使三者失去平衡，从而造成人体疾病发生。基于此原理，藏医治疗疾病的原则也是通过使用饮食、行为、药物和外治疗法等手段，特别是使用药物使三因素重新恢复或调整到相对平衡的状态。
       
       藏医将三因素所引起的疾病都归结为“寒症”“热症”两大类型。肝脏虽因其解毒的特殊功能，泛属热性，但肝硬化属寒症，是因肝脏损伤、肝炎等各种原因发展形成的肝细胞坏死，功能丧失。藏药方剂按疾病的性质也分为“热性”“寒性”两大性能药物，治疗“寒症”时一般使用“热性”药物，但像肝脏类病变器官，因其特殊的血储蓄功能，治疗时必须考虑针对血热的寒性或中性药物的调理或把持。朗庆阿塔就是在综合考虑三因素及主要致病因素和疾病特点来组成的。它依据藏医《四部医典》的第二部《协据》中的药物配伍法为指导，以《医典》第三部《盟阿据》肝病治疗篇为依据，以《医典》第四部《琪玛据》散剂药配方性能学为参考，通过药味配制法与药效配制法的原理精心配置而成，至今已有五百八十多年的应用历史，是治疗肝硬化、肝腹水的有效藏药。
       
       本实验结果提示，朗庆阿塔可均显著降低肝纤维化大鼠血清ALT，AST，ALP活性,减少HA，PⅢNP及肝组织Hyp含量，明显改善肝脏组织病变的状况，肝纤维组织增生、肝细胞脂肪变都有明显减轻，为朗庆阿塔的临床应用提供了科学的实验依据。
       
       致谢：感谢南京军区总医院许瑞杰老师指导放免测定！
       【参考文献】
         　　［1］ 李春辉，潘理会，李春雨.中药强肝溶纤汤对肝纤维化预防及治疗作用的实验研究［J］.辽宁中医杂志，2007,34(5):674.
       
       ［2］ 高玉萍，王宁萍.藏药松石丸对大鼠实验性肝纤维化的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2005，11(5):47.
       
       ［3］ Scott L. Friedman. Liver fibrosis-from bench to bedside ［J］.Hepatology 2003 (38)，S38.