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       【摘要】 
       目的建立超高效液相色谱（UPLC）法测定龙胆药材中活性成分的方法。方法采用L9（34）正交表安排实验，确定最佳提取条件。色谱柱：Shimadzu C18（3.0 mm×75 mm, 1.7 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（V∶V = 5.5∶94.5），流速0.80 ml/min；检测波长235,270 nm；柱温为40℃。结果獐芽菜苦苷、龙胆苦苷分别在0.154 8～1.858 0 mg/ml，0.322～5.152mg/ml范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为102.09%，RSD=1.68％（n=6）；103.80%，RSD=1.11％（n=6）。结论采用UPLC法控制龙胆质量，操作简单,结果准确，方法可行。
       【关键词】  龙胆 超高效液相色谱 獐芽菜苦苷 龙胆苦苷
       Determination of Swertiamarin and Gentiopicroside in Root of Gentiana scabra Bge.by UPLC
       CAO Yue, ZUO Daiying, WU Xiaolan,LIU Jingwu,SUN Qishi*
       （Liaoning Provincial Institute of Food and Drug Control, Shenyang 110023,China； Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016,China; Liaoning Tianrui Science and Technology Development Co., Ltd. Qingyuan, Liaoning 113300, China）
       Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of swertiamarin and gentiopicroside in root of Gentiana scabra Bge.by UPLC.MethodsBy L9（34）orthogonal design, an optimal condition was confirmed. The separation was performed on Shimadzu C18（3.0 mm×75 mm,1.7μm） column, the mobile phase was Acetonitrile-0.1% Phosphorylation（V∶V = 5.5∶94.5）. The  flow rate was 0.8 ml/min, the detection wavelength was 235nm, 270nm, and the column temperature was 40℃.ResultsThis method had good linearity in the range of 0.322～5.152mg/ml,and the average recovery was102.09 % with RSD of 1.68%for swertiamarin. It had good linearity in the range of 0.1548～1.858 mg/ml ,and the average recovery was 103.80% with RSD of 1.11%for gentiopicroside.ConclusionThis method is simple , accurate , and suitable for the quality control of root of Gentiana scabra Bge.by UPLC.
       Key words：Radix Gentiana Scabra Bge.;  UPLC; Swertiamarin;  Gentiopicroside
       
       龙胆为龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag．，龙胆Gentiana scabra Bge．，三花龙胆Gentiana  triflora Pall．或坚龙胆Gentiana rigescens Franch．的干燥根及根茎。具有清热燥湿，泻肝胆火的作用。用于湿热黄疸，阴肿阴痒，带下，强中，湿疹瘙痒，目赤，耳聋，胁痛，口苦，惊风抽搐［1］。龙胆的主要有效成分为环烯醚萜类化合物，有龙胆苦苷（Gentiopicroside）、獐牙菜苦苷（Swertiamarin）及獐牙菜苷（Sweroside）等,这类物质也是其苦味的物质基础［2］。目前采用常规液相分析时一般都需要较长的分析时间，而超高效液相色谱(UPLC)技术的应用，是我们在满足有效分离样品的同时，极大地缩短了分析时间，有效地提高了工作效率，节约了成本。而本文就是采用UPLC建立了一种快速、准确控制龙胆质量的方法。
       1   仪器与试剂
          
       岛津-UPLC超高效液相色谱仪，LC-solution色谱工作站。獐芽菜苦苷对照品（北京中西远大科技有限公司，批号070316 纯度99.06%），龙胆苦苷对照品（中国生物制品检定所，批号110770-200510），磷酸为分析纯，其余试剂均为色谱纯。
       2   方法与结果
       2.1  提取工艺的考察以獐芽菜苦苷和龙胆苦苷为检测指标，选取提取溶剂、提取方法、提取时间3个因素，每个因素3个水平，采用L9（34）正交表进行实验，按“2.4”项制备样品溶液，按“2.5”项条件进行测定。综合直观分析和方差分析的结果，确定最佳提取工艺为：甲醇超声提取30 min。
       2.2   检测波长的选择取獐芽菜苦苷和龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.1 mg/ml的溶液，在200～400 nm进行紫外扫描，结果獐芽菜苦苷的最大吸收波长在235 nm，龙胆苦苷的最大吸收波长在270 nm。
       2.3   对照品溶液的制备分别精密称取獐芽菜苦苷和龙胆苦苷对照品适量,加甲醇制成0.15 mg/ml和0.3 mg/ml的溶液。
       2.4   供试品溶液的制备取龙胆药材，粉碎成中粉，取1g置具塞三角瓶中,精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理30 min（严格控制水温，15 min停1次），冷却至室温，以甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，作为测定獐芽菜苦苷的样品溶液，精密吸取上述溶液5ml，置25ml量瓶中加甲醇溶液稀释至刻度，作为测定龙胆苦苷的样品溶液。
       2.5   色谱条件色谱柱Shimadzu C18 （3.0 mm×75 mm, 1.7 μm）；流动相为乙腈-0.1％磷酸溶液（5.5∶94.5），流速0.8 ml/min，检测波长分别为235 nm和270 nm，柱温40℃，进样量4 μl。
       2.6   线性关系分别精密量取獐芽菜苦苷对照品溶液（c=0.154 8mg/ml）1，2，4，6μl、母液（c=0.309 7 mg/ml）4，6μl注入液相色谱仪中，测定峰面积；分别精密量取龙胆苦苷对照品溶液，（c=0.322 mg/ml）1，2，4，8μl、母液（c=0.644 mg/ml）6μl、8μl注入液相色谱仪中，按照“2.5”项的方法测定峰面积，结果表明，獐芽菜苦苷、龙胆苦苷质量浓度（X）在0.154 8～1.858 0 mg/ml和0.322～5.152 mg/ml与峰面积（Y）呈线性关系。回归方程分别为Y = 889 751X - 9 916.5，r=0.999 8; Y = 805 953X + 25 881, r=0.999 8。
       2.7   精密度实验精密吸取同一供试品溶液4 μl，连续进样5次，獐芽菜苦苷和龙胆苦苷的峰面积RSD分别为1.92％,0.32％（n=5）。
       2.8   重复性实验精密称取龙胆中粉1 g,按“2.4”项制备6份样品溶液，测定，计算獐芽菜苦苷和龙胆苦苷的含量，其RSD分别为0.79％,2.0％（n=6）。
       2.9   稳定性实验取同一供试品溶液分别在0，2，4，6，8，12，16 h测定，结果表明獐芽菜苦苷和龙胆苦苷在16 h内稳定性良好，峰面积RSD分别为1.65％,0.31％。
       2.10   回收率实验分别精密称取已知质量分数的龙胆药材粉末，獐芽菜苦苷0.5 g,龙胆苦苷0.1 g,制备样品溶液，测定，结果獐芽菜苦苷的平均回收率102.09%，RSD为1.68％（n=6）；龙胆苦苷的平均回收率103.80%，RSD为1.11％（n=6）。
       2.11  样品测定18批样品系辽宁天瑞绿色产业科技开发有限公司提供的栽培品。取样品1 g,制备样品溶液，测定，结果见表1。色谱图见图1～4。
       表1  样品测定结果（略）
       3  讨论
          
       从正交实验设计法的实验结果中发现，超声提取和回流提取两种方法，在使用甲醇作为溶剂、提取时间为30 min时，所测定的两个指标性成分的含量基本一致，但考虑到回流的操作相对复杂，而且一旦超出规定的回流时间，两类成分含量损失较大，分析原因是两类成分均为裂环烯醚萜苷类化合物，受热易分解，因此选择了耐用性较好的超声提取方法，并且在操作中严格控制温度。
       
       UPLC法用于药品成分的检测目前还很少，其优点在于不影响正常分离度的情况下，通过缩小填料粒度、增加线流速的情况下，极大地缩短了分析时间。同常规液相相比，一般能够缩短4～10倍的分析时间，提高了工作效率。獐芽菜苦苷和龙胆苦苷均为水溶性成分，极性较大，所采用的流动相水的比例很大，采用常规液相需要100 min，而超高液相仅需要20多分钟，同时满足了獐芽菜苦苷的有效分离度。
       
       所测定的样品均为辽宁清原的道地药材，其龙胆苦苷的含量范围为56.75～85.61 mg/g，远高于《中国药典》［1］规定的10 mg/g的要求。獐牙菜苦苷的含量范围为3.27～5.52 mg/g，其含量的高低基本与龙胆苦苷的趋势一致。
       图1  龙胆苦苷的色谱图（略）
       图2  样品（1）的色谱图（略）
       图3  獐牙菜苦苷的色谱图（略）
       图4  样品（2）色谱图（略）
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005.
       
       ［2］ 郑虎占,董泽宏,佘 靖.中药现代研究与应用，第2卷［M］.北京:学苑出版社,1997：1398.