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       【摘要】 
       目的探讨虫草多糖（Cordyceps Polysaccharides ，CP）对皮肤成纤维细胞光老化的保护作用。方法用8-甲氧补骨脂素联合UVA（8-MOP/UVA）诱导皮肤成纤维细胞光老化，用HE染色、MTT、羟脯氨酸含量、丙二醛含量检测及SOD活力分析等方法观察虫草多糖对成纤维细胞光老化过程中的形态、活力、胶原合成及抗氧化能力的影响。结果光老化组细胞发生形态改变，增殖能力明显下降，羟脯氨酸含量下降，丙二醛含量升高，SOD活力下降，虫草保护组细胞有所改善。结论虫草多糖对8-MOP/UVA诱导皮肤成纤维细胞光老化有拮抗作用。
       【关键词】  虫草多糖（CP） 成纤维细胞 光老化
       Antagonism of Cordyceps Polysaccharides to Photoaging Fibroblasts Induced by 8-MOP/UVA
       LI Hua,YE Tingjie ,LI Boqing，YING Xinping
       （Department of Biology,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai, 201203,China）
       Abstract：ObjectiveTo observe the protective action of cordyceps polysaccharides (CP)on photoaging skin fibroblasts．MethodsPhotoaging skin fibroblast  models were induced by 8-MOP/UVA. Cordyceps polysaccharides was administrated before 8-MOP/UVA .HE stained,MTT, hydroxyproline(HYP), MDA and SOD quantitant were used to test the effects of cordyceps polysaccharides. ResultsCell crimple,condensation of nuclear chromatin in 8-MOP/UVA model group were observed. Compared with model group, cp groups alleviate cell crimple could increase the activity of cell, decrease the content of MDA, and increase the level of HYP and the activity of SOD. ConclusionCordyceps polysaccharides has protective effect on photoaging skin fibroblast.
       Key words： Cordyceps Polysaccharides；  Fibroblast；  Antagonism
       
       皮肤是机体最大的器官，皮肤老化是机体衰老的重要组成部分，并与许多皮肤病的发生也有着病因学的关系，而且有损于美容，因此预防和延缓皮肤衰老已成为生命科学研究的热点之一。皮肤老化包括两个过程，内在老化(intrinsic或chrondogic aging)和光老化(actinic aging或Photoaging)［1］。前者主要受遗传和代谢等因素的影响，可通过改善全身营养代谢平衡等措施加以防护；后者则主要由长期紫外线照射所致，只能通过避免阳光照射和使用防晒药物来预防，而在实际生活中后者是很难避免的。近年来，随着大气臭氧层变薄，照射到地面的阳光紫外线大量增加。阳光中的紫外线包括短波（UVC）、中波 (UVB)和长波紫外线(UVA)，其中UVB和UVA可以穿过大气层到达地面。UVA对皮肤的穿透能力远大于UVB［2］，长时间的UVA照射可导致皮肤的严重伤害而难以治疗，UVA已经成为皮肤真皮衰老的重要原因［3］。有人用冬虫夏草来抗皮肤衰老，但其是否有效及其作用机制还未见报道。本课题就虫草多糖对皮肤光老化的保护作用从细胞水平进行了实验研究。
       1  材料
       1.1  药物和制剂虫草多糖由中草药冬虫夏草提取，纯度大于95％，由上海中医药大学肝病所提供。PRMI 1640培养基、EDTA－胰酶购自GIBCO公司，胎牛血清购自Hyclone公司，MTT购自北京鼎国生物技术有限公司。组织羟脯氨酸试剂盒、丙二醛检测试剂盒、SOD活力检测试剂盒,购自南京建成生物工程研究所。
       1.2  动物昆明种小鼠，出生24 h内，用于原代皮肤成纤维细胞培养，由上海中医药大学实验动物中心提供。
       2  方法
       　　
       2.1  原代皮肤成纤维细胞的培养出生24 h内的新生鼠于75％酒精浸泡片刻，取出，置于Hank"s缓冲液，取背部皮肤，依次于Hank"s缓冲液、1640培养液、20％胎牛血清的1640培养液中漂洗，剪碎、植块培养。
       2.2  光老化模型建立及虫草多糖的保护将培养2～3代的皮肤成纤维细胞转入六孔板，细胞长至50％～60％，正常对照组：正常培养液培养；光老化组：加入100 ng/ml 8-MOP预先孵育24 h，予UVA照射4.1 J/cm2照射，（UVA功率为190 μW/cm2），造模完成后换正常培养液；虫草保护组：100 ng/ml 8-MOP与虫草多糖共同孵育24 h后，予UVA照射2.7 J/cm2照射，虫草多糖浓度为20 μg/ml和40 μg/ml。
       2.3  MTT造模及保护完成后1，2，3，4天进行MTT检测，每组设6个复孔，常规方法进行，结果进行t检验。
       2.4  HE染色造模及保护后24 h进行HE常规染色。
       2.5  羟脯氨酸、丙二醛及SOD活力检测取细胞培养液测丙二醛及SOD活力，细胞用胰酶消化收集，PBS洗2遍，各组加400 μl三蒸水，反复冻溶3次，3 500 r/min离心10 min，取上清测羟脯氨酸含量。方法按试剂盒说明书进行，每次检测同时进行总蛋白检测，重复3次，各组间t检验进行统计分析。
       3  结果
       3.1  虫草多糖对细胞增殖活力的影响MTT结果检测细胞增殖，结果显示：光老化组细胞活力较对照明显下降，虫草保护组有所改善，在低剂量组时效果较明显，虫草多糖浓度为80 μg/ml时细胞活力又下降，结果未显示。由于该原代细胞增殖较慢，所以在检测的4 d里细胞的增殖仍呈上升趋势。见图1。
       图1  虫草多糖对光老化细胞活力影响（略）
       3.2  虫草多糖对细胞形态的影响HE染色结果显示，对照组细胞形态饱满，光老化造模后，细胞贴壁能力下降，培养液中的悬浮细胞逐渐增加，细胞逐渐皱缩、变圆，细胞核发生浓缩，HE染色加深，有虫草多糖保护的细胞，随虫草多糖的浓度增加，细胞形态逐渐接近于对照，虫草浓度为40 μg/ml时，对细胞形态的保护作用最好，浓度为80 μg/ml时，细胞形态又变差，说明该浓度的保护作用不明显，结果未显示。如图2。
       图2  虫草多糖对细胞光老化保护作用的HE染色结果（略）
       3.3  虫草多糖对细胞胶原合成及交联程度的影响羟脯氨酸含量检测结果显示，在光老化组，细胞的羟脯氨酸含量较对照组明显下降，而虫草多糖保护组的羟脯氨酸含量明显回升，并且差异有显著性，该指标反应的是细胞胶原蛋白的含量。丙二醛含量检测显示，在光老化组，丙二醛较对照组明显增高，虫草多糖保护组明显降低，该指标反应的是胶原的交联程度，老化的细胞，交联程度高，年轻的细胞交联程度低。结果如表1。
       表1  虫草多糖对光老化细胞胶原含量及交联程度影响（略）
        
       与对照组比较，aP＜0.05；与光老化组比较，bP＜0.05；与20 μg/ml CP组比较，cP＜0.05
       3.4  虫草多糖对细胞SOD活力的影响细胞培养液测SOD活力，结果显示光老化组细胞的SOD活力明显低于正常对照组，虫草多糖保护组的活力明显高于光老化组，差异有显著性，P＜0.05，20 μg/ml与40 μg/ml差异无显著性。结果见表2。
       表2  虫草多糖对光老化细胞SOD活力的影响（略）
       与对照组比较，aP＜0.05；与光老化组比较，bP＜0.05
       4  讨论
          
       虫草多糖是冬虫夏草的主要活性成分之一，具有抗肝纤维化、抗肿瘤、免疫调节、降血糖等药理作用［4］。近年研究发现虫草多糖对急、慢性肾衰有改善作用［5，6］，抗衰老方面的研究相对较少，李连德等［7］采用从虫草深层发酵产物中提取的多糖进行果蝇抗衰老实验，结果表明，不同来源的虫草多糖对果蝇寿命均有不同程度的延长作用，从而证明虫草多糖有延缓衰老的作用，并且延寿的效果随纯度的增大而提高。本实验室通过制备小鼠的光老化模型，并用虫草多糖保护结果发现虫草多糖对小鼠皮肤的光老化具有拮抗作用。
       
       成纤维细胞是真皮中最主要的细胞成分，在皮肤光老化的形成中具重要作用，对成纤维细胞在皮肤光老化形成中的作用进行研究，可以为阐明皮肤光老化的形成机制及寻找有效的防治手段提供理论依据，同时也为阐明细胞衰老与器官老化之间的关系提供线索。以8－MOP/UVA作用于体外培养的真皮成纤维细胞可以为体外研究皮肤光老化提供很好的模型［8，9］。
       
       本实验结果表明，100 ng/ml 8－MOP联合4.1 J/cm2 的UVA照射作用下，体外培养的小鼠皮肤成纤维细胞迅速出现光老化表现：细胞逐渐皱缩、变圆，核浓缩，HE染色加深，细胞增殖能力下降，羟脯氨酸含量降低，丙二醛含量增高，说明细胞的胶原含量减少，并且胶原间的交联程度增加，SOD活力也下降，表明细胞抗氧化能力下降；而在预先用虫草多糖保护的细胞各种改变均受到了明显的抑制，但是在20 μg/ml和40 μg/ml两组间差别不明显，说明增加剂量对光老化的保护作用没有明显优势。
       
       虫草多糖能够保护皮肤成纤维细胞光老化的机制可能与TGF－β／Smad信号有关。目前发现紫外照射通过抑制TGF－β信号传导途径引起皮肤组织胶原含量的减少［10］。有文献报道，经紫外线照射后，皮肤成纤维细胞TGFβ－Ⅱ受体表达下降，TGF－β/smad信号减弱，从而Ⅰ型胶原的合成降低［11］。现有研究发现TGF－β／Smad信号在多种组织中都参与了胶原的合成，或者引起了组织的纤维化，研究者也试图从干预该信号途径方面来寻找治疗组织纤维化、皮肤创伤愈合及瘢痕形成［12，13］。在保护皮肤光老化的机制方面，Tanaka H等［14］的研究发现革兰氏阴性厌氧菌Zymomonas mobilis的可发酵代谢物通过提高TGF－β／Smad信号来改善皮肤成纤维细胞的光老化，该代谢物可以抑制UVB照射引起的TβR－II mRNA和蛋白的下降，从而恢复Ⅰ型胶原合成的下降，抑制了光老化。虫草多糖对成纤维细胞光老化的保护或许也可通过影响TGF－β／Smad信号来实现。
       【参考文献】
         　　［1］ Fisher GJ. The pathophysiology of photoaging of the skin. Cutis［J］. 2005，75(2 Suppl):5.
       
       ［2］ 涂国荣，王旭辉.紫外线对皮肤的光辐射损伤与防护研究［J］. 日用化学工业，2002，32（1）：55.
       
       ［3］ Kligman LH，Akin FJ，Kligman AM．The contribution of UVA and UVB to connective tissue damage in hairless mice［J］. J Invest Dermatol，1985，84（4）：272.
       
       ［4］ 郭风彩，陈国民.冬虫夏草多糖的药理学研究进展［J］. 现代医药卫生，2006，22（7）：999.
       
       ［5］ 尹鸿萍，王小波，陈 希.虫草多糖治疗家犬夹闭肾动脉引起的急性肾衰［J］. 生物加工过程,2007,5(4):70.
       
       ［6］ 尹鸿萍，王小波，陈 涛.虫草多糖对腺嘌呤诱发慢性肾衰大鼠的治疗作用［J］. 中药新药与临床药理,2007,18(6):451.
       
       ［7］ 李连德，樊美珍.14种虫草多糖对果蝇成虫寿命的影响的试验［J］. 微生物学通报,2000，27（6）：428.
       
       ［8］ Ma W，Wlaschek M，Tantcheeva-Poor I, et al.Chronological ageing and photoaging of the fibroblasts and the dermal connective tissue［J］. Clin Exp Dermatol，2001，26（7）：592.
       
       ［9］ Yin L，Morita A，Tsuji T.Skin aging inducing by ultraviolet exposure and tobacco smoking：Evidence from epidemiological and molecular studies［J］. Photodermatol Photoimmunol Photomed，2001，17（4）：178.
       
       ［10］ Rittie L, Fisher GJ. UV-light-induced signal cascades and skin aging［J］. Ageing Res Rev, 2002 ,1(4):705.
       
       ［11］ Quan T, He T, Kang S,et al. Solar ultraviolet irradiation reduces collagen in photoaged human skin by blocking transforming growth factor-beta type II receptor/Smad signaling［J］. Am J Pathol, 2004 ，165(3):741.
       
       ［12］ Christiane A，Amerit M.Resistance of keratinocytes to TGFβ-mediated growth restriction and apoptosis induction accelerates re-epithelialization in skin wounds［J］. Journal of Cell Science,2002，115:2189.
       
       ［13］ Gu L,Zhu YJ, Yang X,et al. effect of TGF-beta/smad signaling pathway on lung myofibroblast differentiation［J］. Acta pharmacol sin, 2007，28(3):382.
       
       ［14］ Tanaka H,Yamaba H,Kosugi N,et al.Fermentable metabolite of Zymomonas mobilis controls collagen reduction in photoaging skin by improving TGF-beta/Smad signaling suppression［J］. Arch Dermatol Res,2008，300(Supplement 1):57.