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       【摘要】 
       目的观察丹参提取物（SM）对高脂地鼠血脂和血糖代谢的影响并初步探讨其机制。方法高脂饲料诱导高脂金黄地鼠模型，设正常组，模型组，辛伐他汀组(1 mg·kg－1)，SM给药组(4.5，9.0 g·kg－1)。每两周检测一次血清TC，TG， HDL-C和LDL-C水平。49 d后剖杀地鼠，检测血脂4项指标、血糖、ApoA1/B，MDA与FFA水平以及SOD活力。HE染色观察地鼠肝脏病变。结果SM明显降低高脂地鼠血清的TC,TG,LDL-C,ApoB,MDA与FFA水平，轻微升高血糖浓度，明显升高SOD活性，而对HDL-C与ApoA1水平无明显作用。HE染色表明丹参可明显改善高脂地鼠的肝细胞脂肪变性。结论SM能有效调节高脂地鼠的糖脂代谢，其调脂机制可能与其降低ApoB与FFA水平以及抗氧化功能有关。
       【关键词】  丹参 高脂 超氧化物歧化酶 丙二醛 载脂蛋白 游离脂肪酸
       Effects of the Extracts of Salvia miltiorrhiza on Metabolism of Plasma Lipid and Glucose in Hyperlipidemic Hamsters
       WANG Zhuo, ZHU Baochang, XU Nannan, JIN Jin, TANG Fuli, HU Wenxiang*
       (Department of Chemistry，Capital Normal University， Beijing，100037, China;  College of Life Science，Capital Normal University，Beijing，100037, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of the extracts of Salvia miltiorrhiza（SM）on metabolism of plasma lipid and glucose in the hyperlipidemic hamsters and the related mechanism.MethodsHyperlipidemic model was induced by high fat diet (HFD) in hamsters, and five groups were designed: normal control (NC), model control (MC), Simvastatin group (1.0 mg·kg-1), and SM groups (4.5, 9.0 g·kg-1). The levels of TC, TG, HDL-C, and LDL-C were determined every two weeks. After medication for 49 days, all hamsters were killed, and the levels of plasma TC, TG, HDL-C, LDL-C, glucose, ApoA1/B, MDA, FFA and the activity of superoxide dismutase (SOD) were determined. The pathological changes of the hepatic tissues were observed by HE staining.ResultsCompared with MC, SM reduced the levels of plasma TC, TG, LDL-C, MDA, ApoB and FFA significantly, enhanced the activity of SOD obviously, and decreased blood glucose level slightly, but had no apparent effect on HDL-C or ApoA1 level in hamsters. HE staining observation showed that SM could improve the fatty denaturalization of hepatic cells in hyperlipidemic hamsters.ConclusionSM could regulate the abnormal metabolism of plasma lipid and glucose in hyperlipidemic hamsters induced by HFD, and the mechanism of regulating lipids may be related to its reducing ApoB and FFA levels and anti-oxidation.
       Key words:Salvia miltiorrhiza;  Hyperlipidemia;  SOD;  MDA;  Apolipoprotein;  FFA
       
       丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根及根茎，其味苦，性微寒，归心、肝二经，属于常用中药。现代药理学研究证明，丹参具有改善血液流变性及微循环、抗心脑缺血损伤、减轻肝细胞脂肪变性、抗菌消炎以及抗肿瘤等多种药理作用［1］。
       
       以往对丹参作用的研究主要集中在循环系统上，近年来的研究表明丹参提取物还具有降脂的功效，并且在临床治疗中得到了广泛的证实。然而，对丹参降脂作用的研究主要体现在对复方丹参药物的药效研究上，如薛洁等［2］证实消瘀片（丹参和山楂提取物组成）具有较好的降血脂和抗动脉粥样硬化作用；吴开木等［3］发现复方丹参滴丸对2型糖尿病高血脂症患者具有降低TC、TG与ApoB，升高HDL-C与ApoA的作用。对于单方中药丹参提取物的调脂作用及其机制的研究却一直很少。且目前的实验多采用大鼠或小鼠作为实验动物，而有研究证明地鼠体内的糖脂代谢情况比大鼠和小鼠更接近人类［4］，因此采用地鼠作为实验动物对于临床用药和新药开发具有指导意义。
       
       本实验以高脂饲料诱导的高脂血症地鼠作为动物模型，研究单方中药丹参对地鼠体内糖脂代谢的调节并初步探讨其相关作用机理。
       1  器材与方法
       1.1  试剂与药品中药丹参饮片购于北京市京卫大药房，符合《中国药典》2005年版Ⅰ部有关各项规定，经北京市同仁堂科学研究所高级工程师范国强教授鉴定为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根茎。辛伐他汀片（利之舒），哈药集团三精股份有限公司生产。总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)(批号070431)、葡萄糖 (批号070161)与载脂蛋白A1/B（ApoA1/B）（批号070161）测定试剂盒均由北京中生北控生物科技股份有限公司提供。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)(批号070531)以及游离脂肪酸（FFA）（批号070621）测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。其余试剂均为国产分析纯。
       1.2  实验动物金黄地鼠，雄性，体重50～70 g，清洁级，饲养于18～22℃，12 h交替光照，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号为SCXK(京)2006-0008。
       1.3  饲料配方普通饲料和高脂饲料(High Fat Diet, HFD)均由北京科澳协力饲料有限公司提供。高脂饲料配方为：1.5%胆固醇、0.15%甲基硫氧嘧啶、0.5%胆酸钠、10%猪油、2%蛋黄、1%氯化钠以及84.85%基础饲料。
       1.4  仪器MD-200半自动生化分析仪(美国)。Thermo CR 3i高速冷冻离心机（美国）。TECAN Sunrise酶标仪（瑞士）。Leica自动脱水机，包埋机，染色机，切片机以及倒置显微镜 (德国)。
       1.5  丹参饮片提取工艺［5］丹参400 g，先后分别加入12，10与8倍体积水，并分别煎煮90，60与45 min。取纱布过滤并合并滤液，浓缩至0.33 g·ml-1（生药量），即得丹参提取物（Salvia miltiorrhiza, SM）。
       1.6  高脂地鼠模型的建立参照文献［6］建立高脂地鼠模型。选择雄性金黄地鼠60只，适应性喂养1周后，按体重随机分为正常对照组(10只，喂饲普通饲料)和模型组(50只，喂饲高脂饲料)。每两周眼眶静脉丛采血1次，分离血清并检测TC，TG，LDL-C及HDL-C水平（按试剂盒说明书检测）。8周后取TC，TG及LDL-C 含量升高并与正常组差异显著的地鼠作为成功高脂模型纳入试验。
       1.7  分组给药选择符合标准的高脂模型地鼠40只，根据空腹血脂数值，随机分为4组，即模型组，辛伐他汀组，SM低、高剂量组，每组10只。正常组（NC）和模型组（MC）灌喂相应体积蒸馏水；辛伐他汀组（SIM）给药剂量为1 mg·kg-1；SM低、高剂量组给药剂量分别为(生药材)4.5，9.0 g·kg-1。各组每日灌胃1次，每次灌胃体积按10 ml·kg-1体重计算。用药期间，除正常组外其余各组地鼠均饲以高脂饲料，自由进食、饮水。每2周眼眶静脉丛采血1次，监测血脂4项指标的变化。
       1.8  血清生化检查用药第49天，禁食(不禁水)12 h，末次给药2 h后，用0.3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，低温离心，分离血清，分装于1.5 ml EP管中，-20℃保存待检。同时迅速剥取肝脏组织，置于10％多聚甲醛固定液中保存。分别检测地鼠血清中的TC及TG(酶比色法)、HDL-C(磷钨酸-镁沉淀法)、LDL-C(聚乙烯硫酸沉淀法)、血糖 (葡萄糖氧化酶法)、ApoA1及ApoB(免疫透射比浊法)、SOD及MDA〔硫代巴比妥酸缩合法（TBA））〕及FFA（比色法）水平（均按试剂盒说明书检测）。并按照AI=LDL-CHDL-C公式计算动脉硬化指数(AI)，R-CHR=TCHDL-C计算冠心指数(R-CHR)。
       1.9  病理组织切片观察取出固定于多聚甲醛溶液中的地鼠肝脏组织，切成半径0.5 cm小块，放入包埋盒中，用自动脱水机与包埋机进行常规脱水，浸蜡与包埋。用切片机将包埋后的组织切成5 μm的薄片，于40℃水中展片，再用APES粘片剂处理的载玻片捞起后于50℃左右烘干。在染色机上脱蜡后，进行HE染色。用中性树胶封片后置于通风橱中充分干燥，再于倒置显微镜下进行观察，并采集图像。
       1.10  统计学处理结果均以±s表示，用SPSS 12.0对数据进行t检验，多组间比较用单因素方差分析。
       2  结果
       2.1  SM对高脂地鼠体重的影响由表1可见，喂养了8周高脂饲料的金黄地鼠体重显著高于正常组(P<0.01)。用药治疗7周后，SIM与SM给药组地鼠的体重均低于高脂模型组，但SM给药组与模型组之间的差异不显著，表明SM降低高脂地鼠体重的作用不明显。
       2.2  SM对高脂地鼠血脂和血糖的影响如表2所示，模型组地鼠血清中的TC，TG，LDL-C以及血糖水平均为最高，同时HDL-C水平最低。而低、高剂量SM组能明显降低地鼠血清的TC，TG及LDL-C浓度（P<0.05或P<0.01)，其调脂效果接近于辛伐他汀。同时SM还能降低高脂地鼠的血糖水平，尽管降低程度与模型组比较差异不显著，但仍然可以提示SM具有降低血糖的潜在功能。
       表1  SM 对高脂地鼠体重的影响（略）
       与正常组比较，*P< 0.05,**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01，饲喂HFD后8周开始给药治疗
       表2  SM对高脂地鼠血清中TC, TG, HDL-C, LDL-C及血糖浓度的影响（略）
       与正常组比较，*P< 0.05,**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01
       2.3  SM对高脂地鼠动脉硬化指数（AI）和冠心指数（R-CHR）的影响根据地鼠血清中TC，HDL-C和LDL-C的浓度，我们对每组地鼠的动脉硬化指数 (AI) 与冠心指数(R-CHR) 进行了计算。结果表明SM给药组中地鼠的AI(P<0.05或P<0.05)与R-CHR (P <0.05或P<0.01)数值均显著降低，且呈剂量依赖性关系（图1～2），揭示出SM具有降低高脂地鼠AI与R-CHR的效果。
       2.4  SM对高脂地鼠血清中ApoA1/ApoB水平的影响由表3可见，SM和SIM均能显著降低ApoB水平（P<0.05或P<0.01），同时SIM还能明显升高地鼠血清的ApoA1水平（P<0.01)，SM也能升高地鼠血清中的ApoA1水平，但差异不显著。
       与正常组比较，*P< 0.05,**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05, △△P<0.01
       图1  SM对高脂地鼠动脉硬化指数(AI) 的影响（略）
       
       与正常组比较，*P< 0.05,**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05, △△P<0.01
       图2  SM对高脂地鼠冠心指数 (R-CHR)的影响（略）
       表3  SM对高脂地鼠血清中ApoA1/ApoB浓度的影响（略）
       与正常组比较，*P< 0.05,**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01
       2.5  SM对高脂地鼠血清中MDA水平和SOD活力的影响为了观察SM的抗氧化活性，我们对地鼠血清中的SOD活性与自由基产物MDA浓度进行了检测 (见表4)。结果显示，模型组地鼠的MDA水平最高〔(19.67±0.03)nmol·L-1〕，SOD活性最低〔(55.93±0.02)U·ml-1〕；而SM低、高剂量给药组均可显著降低地鼠血清中的MDA水平（(P<0.05或P< 0.01），且升高其SOD活性(P<0.05或P<0.01), 并呈现剂量依赖性关系。提示SM可能通过发挥抗氧化作用达到调节血脂的效果。
       表4  SM对高脂地鼠血清中MDA水平与SOD活性的影响（略）
       与正常组比较，*P< 0.05,**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01
       2.6  SM对高脂地鼠血清中FFA水平的影响由图3可见，同正常地鼠相比，高脂饲料诱导的地鼠血清中FFA水平显著升高(P<0.01)，而低、高剂量组SM均可显著降低高脂地鼠血清中的FFA水平(P<0.01或P<0.01)，其降低FFA的效果优于辛伐他汀（P<0.05）。
       2.7  病理组织切片观察对地鼠肝脏组织切片的观察如图4所示。正常地鼠的肝细胞排列整齐，胞质均匀，细胞核清晰，位于细胞正中，而高脂地鼠的肝细胞排列混乱，细胞核被挤向一边，且体积增大，脂肪变性现象比较明显，胞浆内充满大小不等的脂肪滴。SIM与SM给药组均可改善高脂地鼠肝细胞脂肪变性的现象。
       3  讨论
          
       丹参在我国是一种家喻户晓的中草药。现代医学认为，丹参具有抗心脏缺血、抗心肌梗死、抗血栓、改善微循环、降血脂、抗动脉粥样硬化、护肝以及抗氧化等作用，尤其在治疗心血管紊乱（中医上称血瘀）方面具有良好的疗效［1］。
       
       本研究主要观察了丹参提取物对高脂饲料诱导的高脂血症地鼠体内糖脂代谢的影响，并探讨了相关作用机制。实验中观察了丹参对高脂饮食诱导的高脂血症地鼠的治疗作用，并与西药辛伐他汀对比，发现丹参提取物能明显降低地鼠的TC，TG以及LDL-C水平，使其动脉硬化指数和冠心指数明显降低，其效果接近于辛伐他汀，说明丹参具有较好的调节血脂的作用，同时还能降低动脉粥样硬化与冠心病的危险性，因此可用来预测心血管病发生的几率［7］。丹参还可使血糖浓度轻微的降低，对于高脂血症引起的血糖升高具有一定的改善作用。
       与正常组比较，*P< 0.05,**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05, △△P<0.01
       图3  SM对高脂地鼠血清中FFA水平的影响（略）
       1.正常对照组;  2.模型组;  3.辛伐他汀组 (1.0 mg·kg-1);  4.SM低剂量组 (4.5 g·kg-1);  5.SM高剂量组(9.0 g·kg-1)
       图4  地鼠肝脏组织石蜡切片与HE 染色(200×)（略）
       
       此外，我们对丹参调脂的机制也做了初步的研究。超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内清除超氧化物阴离子自由基的重要金属酶类，其功能为催化超氧阴离子发生歧化反应，清除自由基，从而维护生物体内细胞正常的生理代谢和生化反应［8］。目前认为，冠心病发生、发展的某些病理过程和环节与脂质过氧化损伤有关。本实验中高脂地鼠灌服丹参提取物后，体内的自由基产物MDA水平明显降低，且SOD活性明显升高，提示丹参调节血脂的过程可能与其发挥抗氧化功能有关。Wu等［9］发现丹参降低动脉粥样硬化发病率的原因不仅与其降低胆固醇水平有关，更在于其发挥抗氧化功能以阻止内皮损伤并阻止高胆固醇血症的LDL氧化修饰有关，与本研究的结果一致。
       
       ApoA1是HDL的重要蛋白组成成分，在胆固醇逆向转运途径中发挥着关键的作用，ApoA1的过度表达可以引起HDL-C的升高，起到阻止动脉粥样硬化发生的作用［10］。而ApoB是构成LDL-C的主要蛋白成分，ApoB表达的增加与LDL的变化呈正相关。本实验中SM给药组可以明显降低LDL-C与ApoB水平，而对HDL-C与ApoA1的变化不明显。此外，高脂血症地鼠血清中FFA的水平明显升高，而丹参可以明显降低其FFA水平，且其降低FFA效果不亚于辛伐他汀。这些结果揭示出丹参的调脂机制可能与降低ApoB与FFA水平有关。
       
       关于丹参调脂作用分子机理的研究，国内学者发现丹参的有效成分之一丹参素钠能明显增加CYP7A mRNA表达，促进胆固醇转化为胆汁酸，从而降低血浆中的胆固醇含量，提示其作用机制可能与LXRα和PPARα同相应的配体结合，诱导CYP7A转录有关［11］。
       
       综上所述，传统中药丹参的应用与本研究所得数据一致，其提取物具有显著调节地鼠血脂和一定程度的降血糖作用，具有抗氧化功效与保护肝脏的潜力，具有开发调脂药物的良好前景。然而，关于丹参发挥调脂作用的分子机理还需要进一步大量的实验加以探索，本实验室正在通过HepG2细胞进行丹参及其有效成分调脂分子机理的研究。
       【参考文献】
         　　［1］ Begum H, Todd O, Yi ZZ. Effects of purified Salvia miltiorrhiza extract on cardiac vascular smooth muscle hypoxic cells［J］.J pharm sci, 2007, 104: 202.
       
       ［2］ 薛 洁，谢梅林，顾振纶，等. 丹参和山楂提取物含药血清对胆固醇代谢的影响［J］.中草药，2007，38 (1): 73.
       
       ［3］ 吴开木，吴林岚，林宇丸. 复方丹参滴丸对2型糖尿病高血脂症的影响［J］.海峡药学，2002，14(3): 54.
       
       ［4］ 唐世英，胡桂才，李可基，等.金黄地鼠高脂血症动物模型的应用研究［J］.承德医学院学报，2002，19(3): 173.
       
       ［5］ 蒋树林，姚希贤，吕 涛. 丹参抑制大鼠肝纤维化线粒体脂质过氧化［J］.世界华人消化杂志, 2002, 10 (11): 1253.
       
       ［6］ 骆庆峰，孙 兰，斯建勇，等. 木豆叶芪类提取物对高脂模型小鼠血脂和肝脏胆固醇的降低作用［J］.药学学报，2008，43(2): 145.
       
       ［7］ Schmidt C, Fagerberg B, Wikstrand J, et al. ApoB/ApoA1 ratio is related to femoral artery plaques and is predictive for future cardiovascular events in healthy men［J］.Atherosclerosis, 2006, 189 (1): 178.
       
       ［8］ 田艳燕，葛 兰，段相林，等. 番茄红素脂质体的体外释放及大鼠体内药代动力学和抗氧化功能［J］.药学学报, 2007, 42(10): 1107.
       
       ［9］ Wu YJ, Hong CY, Lin SJ, et al. Increase of vitamin E content in LDL and reduction of atherosclerosis in cholesterol-fed rabbits by a water-soluble antioxidant-rich fraction of Salvia miltiorrhiza［J］.Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, 1998, 18 (3): 481.
       
       ［10］ Baroukh N, Ostosa MA, Vergnes L, et al. Expression of human apolipoprotein A-I/C-III/A-IV gene cluster in mice reduces atherogenesis in response to a high fat-high cholesterol diet［J］.FEBS Letters, 2001, 502: 16.
       
       ［11］ 薛 洁，谢梅林，顾振纶. 丹参提取物调脂作用机制［J］. 江苏医药，2006，32（8）：752.