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       【关键词】  柴胡；,,柴胡皂苷a；,,柴胡皂苷d；,,高效液相色谱
       摘要：目的采用高效液相色谱蒸发光散射（HPLCELSD）法建立柴胡中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的含量测定方法，并测定不同产地柴胡中柴胡皂苷a，d的含量。方法采用 Phnomenex C18 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm ), 乙腈水（43∶57）为流动相, 流速0.8 ml/min，Alltech ELSD2000ES蒸发光散射检测器,漂移管温度99℃，气速3.0 L/min, 外标法定量。结果柴胡皂苷a 在0.296～2.96 μg范围内呈良好线性关系, 回归方程为Ya=1.387 6X-2.920 2（r=0.999 8）,平均回收率为97.4%,RSD为2.39%(n=6)；柴胡皂苷d 在0.299～2.99 μg范围内呈良好线性关系,回归方程Yd=1.259 5X-1.290 6（r=0.999 6）,平均回收率为98.1%,RSD为2.47%       (n=6)。结论 该方法简便易行,结果准确,重现性好，可作为柴胡药材质量控制的方法。
       关键词：柴胡；  柴胡皂苷a；  柴胡皂苷d；  高效液相色谱蒸发光散射
       Determination of Saikosaponin a and d in Radix Bupleuri by HPLCELSD
       SONG Honggang ， XU Honghui ， PEI Caiyun ， ZHAO Shaohua ， LI Wenlie
       (Hebei Yiling Pharmaceutical Research Institute, Shijiazhuang， 050035， China )
       Abstract：ObjectiveTo establish a determination method of saikosaponin a and d in Radix Bupleuri using HPLCELSD.MethodsPhnomenex C18 column (250 mm×4.6 mm ,5μm) was used.The mobile phase was a mixture of acetonitrile-water(43∶57).The flow rate was 0.8 ml/min. Alltech ELSD2000ES evaporative light scattering detector was used as detector. Drift tube temperature was 99℃.The gas flow was 3.0 L/min.The external standard method was used.ResultsSaikosaponin a was linear in the range of 0.296～2.96 μg.     The regression equations was Ya=1.3876X-2.9202（r=0.9998）.The average recovery was 97.4%( RSD = 2.39%, n=6);Saikosaponin d was linear in the range of 0.299～2.99μg. The regression equations was Yd=1.259 5X-1.290 6（r=0.999 6）.The average recovery was 98.1% ( RSD = 2.47% ,n=6). Conclusion This method was simple and easy to perform and the results obtained were accurate and reproducible.It can be used for the quality control of Radix Bupleuri.
       Key words：Radix Bupleuri;  Saikosaponin a;  Saikosaponin d;  HPLCELSD
   
　　柴胡为常用中药, 始载于《神农本草经》，被列为上品，性微寒，味苦，具有和解表里、疏肝、升阳之功效，用于感冒发热，寒热往来，胸胁胀痛等症。《中国药典》2005年版规定,柴胡Bupleurum chinense DC.和狭叶柴胡Bupleurum scozonerifolium  Willd.为柴胡的正品来源，但未规定含量测定方法。柴胡中主要含皂苷、黄酮、多糖等成分，其中柴胡总皂苷和柴胡皂苷a，d 具有解热、镇痛、抗炎、免疫调节、抗肝损伤、抗肝纤维化等药理活性［1］， 是柴胡的主要有效成分。因此，建立柴胡中柴胡皂苷a，d 的含量测定方法, 可作为控制柴胡生药质量的重要手段。本实验探讨了采用HPLCELSD 法测定柴胡中柴胡皂苷a，d含量的方法,并对不同产地收集的柴胡样品进行了含量测定。
       　　1  仪器与材料
       1.1  仪器与试药Agilent 1100型高效液相色谱仪,美国Alltech ELSD2000ES蒸发光散射检测器。水为自制重蒸水，乙腈为进口色谱纯, AB8大孔吸附树脂（天津南开大学化工厂提供），其余试剂、试药均为分析纯, 柴胡皂苷a对照品（批号110777200301）、柴胡皂苷d对照品（批号110778200301）均购自中国药品生物制品检定所（经归一化法测定，纯度分别为98.1%，98.6%）。
       1.2  材料不同产地柴胡共10份样品, 由河北省药品检定所中药鉴定室孙宝惠主任药师鉴定。
       　　2  方法及结果
       2.1  色谱条件色谱柱为Phnomenex C18 柱(250 mm×4.6 mm，4 μm )；流动相乙腈水（43∶57）；流速0.8 ml/min；柱温为室温；漂移管温度99℃，气速3.0 L/min。
       2.2  对照品溶液制备精密称取柴胡皂苷a，d对照品各10 mg,分别置25 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液。分别精密量取2 ml,置25 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
       2.3  供试品溶液制备取已干燥的柴胡样品适量,粉碎, 过80 目筛。精密称取0.5 g,置锥形瓶中,精密加入甲醇50 ml，密塞，称重，超声提取45 min，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量。滤过，取续滤液25 ml,挥干,残渣加水20 ml溶解，转移至已处理好的AB8大孔吸附树脂（柱内径1.5 cm,柱高12 cm）上，依次用氨试液100 ml洗脱，弃去，水100 ml洗脱，弃去，乙醇150 ml洗脱，收集洗脱液，挥干，残渣加流动相溶解, 转移至10 ml量瓶中, 定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
       2.4  线性关系考察精密吸取对照品溶液10，20，30，40，50，100 μl注入高效液相色谱仪，进行测定,以峰面积的自然对数值(X)对进样量的自然对数值(Y)作图得标准曲线, 数据经回归处理,回归方程为:柴胡皂苷a Ya=1.387 6X-2.920 2, r=0.999 8；柴胡皂苷d Yd=1.259 5X-1.290 6, r=0.999 6。线性范围柴胡皂苷a 0.296～2.96 μg, 柴胡皂苷d 0.299～2.99 μg。
       2.5  精密度实验取对照品溶液和供试品溶液各一份，分别重复进样6次,测定柴胡皂苷a，d的峰面积, 计算相对标准偏差,结果对照品溶液中柴胡皂苷a，d 的RSD 分别为0.69% 和0.64%，供试品溶液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 的RSD 分别为0.83% 和0.88%。
       2.6  稳定性实验按照对照品溶液和供试品溶液制备方法，分别制备对照品溶液和供试品溶液，室温下放置,分别于0，2，4，6，8，12 h进样测定,记录柴胡皂苷a、d的峰面积,计算相对标准偏差,结果对照品溶液中柴胡皂苷a 和d的RSD 分别为1.13% 和1.08%,供试品溶液中柴胡皂苷a 和d的RSD 分别为1.58% 和1.49%,表明对照品溶液和供试品溶液在12 h内稳定。
       2.7  重复性实验取同一柴胡样品，按供试品溶液制备项下的方法制备6份供试品溶液, 分别进样 ,测定柴胡皂苷a，d 峰面积,计算含量和相对标准偏差,结果柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的RSD 分别为1.83%和1.79%。
       2.8  回收率实验精密称取已知含量的柴胡样品0.25 g, 按照加入量与所取供试品含量比为1∶1的比例加入柴胡皂苷a，d对照品，按供试品溶液制备项下的方法制备供试品溶液,分别进样测定, 计算实测含量和回收率。结果表明, 柴胡皂苷a 的平均回收率为97.4%,RSD为2.39% (n=6), 柴胡皂苷d 的平均回收率为98.1%,RSD为2.47% (n=6)。
       2.9  含量测定不同产地柴胡样品结果见表1。对照品、样品色图谱见图1。
       1.柴胡皂苷a     2. 柴胡皂苷d
       图1 混合对照品(a) 和柴胡(b)的HPLC 图谱（略）
       　3  讨论
       3.1  根据文献报道［2,3］，在酸性条件下，柴胡皂苷a，d分子结构中的环氧醚键会开环转化为具有共轭双键结构的柴胡皂苷b1 和b2, 所以通常采用弱碱性溶剂提取原生柴胡皂苷。本实验通过对5％的氨水甲醇、5％的吡啶甲醇及甲醇3种不同溶剂的比较,发现采用碱性溶剂提取，色谱图中杂质峰面积较大，而柴胡皂苷a，d的含量与采用甲醇为溶剂相比，无显著性差异，故选择甲醇作为提取溶剂。
       表1  不同产地柴胡中柴胡皂苷a和d的含量测定结果（略）
       3.2  柴胡中含有黄酮、多糖等多种成分，实验过程中发现，这些成分若不除去，影响柴胡皂苷a，d 的色谱分离和准确定量。通过对正丁醇萃取法和大孔吸附树脂法的纯化效果的比较，发现二者的纯化效果相似，但在重复性、回收率两方面，大孔吸附树脂法优于液液萃取法。柴胡皂苷a，d在碱性溶剂中相对稳定，我们选择了先用氨试液，再用水洗脱的方式，结果有效除去了其它成分的干扰。
       3.3  柴胡皂苷a，d 为齐墩果烷型三萜皂苷，分子结构中仅有一个双键。有关柴胡皂苷a，d的HPLC法测定［4,5］，多采用203 nm左右作为检测波长，但利用末端吸收进行定量分析，对流动相纯度要求较高, 而且检测灵敏度低，基线易发生漂移，采用蒸发光散射检测器基线平稳，检测灵敏度显著提高。
       3.4  含量测定结果表明，不同品种柴胡中柴胡皂苷a、d的含量相差较大，同一品种的不同产地含量差别亦比较悬殊，可能与生长环境、栽培、采收、加工等因素有关，有待进一步研究。
       　　参考文献：
       ［1］  朱兰香，刘世增，顾振纶.柴胡皂苷的药理作用及抗肝纤维化的应用［J］.中草药，2002，33     (10):附5.
       ［2］  刘密新，吴筑平，杨成对，等.对中药复方中柴胡皂甙A 和D的LC/MS/MS研究［J］.质谱学报，2000，21(3,4):77.
       ［3］  茅仁刚，林东昊，王智华，等.HPLC 法测定不同品种柴胡中的柴胡皂苷a、c、d 的含量［J］.中草药，2002，33(5):412.
       ［4］  于健东，杨  青，王钢力，等.HPLC 法测定柴胡中柴胡皂苷的含量及皂苷类成分指纹图谱初步研究［J］.中国中医药信息杂志，2004，11（2）：137.           
       ［5］  尚明远，袁本香，王英华.HPLC法测定宁夏产柴胡中柴胡皂苷a、d的含量［J］.西北药学杂志，1998，13（4）:153.
       (河北以岭医药研究院，河北 石家庄  050035）