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       【摘要】 
       目的从滇南黄草乌Aconitum vilmorimianum Kom.植物的根和茎中分离内生真菌，并进行初步鉴定和抗菌活性筛选。方法经显微形态观察进行内生真菌的分类鉴定，同时采用纸片法进行抗菌活性筛选。结果从滇南黄草乌植物中分离获得37株内生真菌，其中14株内生真菌有抗菌活性，占菌株数的37.84%；镰孢霉属（Fusarmm）是抗菌活性菌株的优势种属；青霉属（Penicinium）的抗菌活性高且抗菌谱广。结论滇南黄草乌植物内生真菌中广泛分布着有抗菌活性的菌株。
       【关键词】  滇南黄草乌 内生真菌 抗菌活性
       Antibacterial Activity of Endophytic Fungi in Aconitum
       LI Zhiying, YANG Liyuan, LI Shaolan, CHEN Youwei, WU Shaohua
       （Yunnan Institute of  Microbiology，Yunnan University，Kunming 650091，China ）
       Abstract:ObjectiveTo isolate and identify some endophytic fungi from the root and stem of Aconitum vilmorimianum Kom.plant and its antibacterial activities were tested.MethodsEndophytic fungi were morphologically identified and its antibacterial activities were screened by scrip testing.Results37 strains of Endophytic fungi were isolated from the root and stem of Axonitum vilmlrimianum Kom plant，14 trains(37.84% of total strains)of them had the inhibitory action on microorganism，and Fusarium species was obviously dominant families among antibacterial activities strains，Penicillium species had evident inhibitory activity.ConclusionThere are many antibacterial strains in Aconitum vilmorimianum Kom.
       Key words：Aconitum vilmorimianum Kom;  Endophytic fungi;  Antibacterial activity
       
       黄草乌为毛莨科乌头属植物Aconitum vilmorimianum Kom，的干燥块根，俗称大草乌。野生滇南黄草乌是植物卡氏乌头的侧生块根，别名藤乌、黄草乌、小草乌，属藤本耐寒植物［1］。黄草乌，云南素有大补药之称，是云南白药等名贵中成药的主要原料之一，有搜风、除湿、活血、止痛等功效。
       
       加强对乌头属植物的活性成分、药用价值的研究，以开发新的药用植物资源，从而缓解我国中药资源日益减少与药用植物资源需求量的不断增加之间突出矛盾。毛茛科是含有毒植物种类最多科之一，其中乌头属是我国最早记载的有毒植物〔2〕，在开发利用的同时必须采取正确的措施以降低其毒性。本研究的目的旨在为保护滇南黄草乌植物资源、开发新型抗菌药物、解决多年来困扰临床的乌头碱的毒性问题寻找新途径。
       1  材料与方法
       1.1  植物样品滇南黄草乌Aconitum vilmorimianum Kom植物采自云南省会泽县大海乡中草药种植基地，海拔3 150 m。
       1.2  指示菌本次实验所用的指示菌均由云南省微生物研究所真菌资源与菌种保藏室提供。所用指示菌参照国家新药筛选中心的植物内生菌抗菌筛选模型进行选取。
       
       金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (G+)，藤黄八叠球菌sarcina lutea (G+)，大肠埃希氏杆菌Escherichia coli(G-)，铜绿假单孢菌(绿脓杆菌) Pseudomonas aeruginosa(G-)。白假丝酵母(白色念株菌) Candida albicans，星形石膏样毛癣菌(须疱毛癣菌) Trichophytongypseum asteroides。
       1.3  培养基PDA培养基(马铃薯葡萄糠培养基)，临用时每毫升培养基中加80单位的青霉素以抑制细菌生长；促孢培养基(KH2PO4，MgSO4·7H2O，KNO3，KCl，葡萄糖，蔗糖)；营养肉汤培养基（蛋白胨，牛肉膏，NaCl)；沙博弱氏培养基(葡萄糖，蛋白胨)。
       1.4  内生真菌的分离首先用自来水冲洗净川乌植物的根、茎表面的泥沙，接着进行表面消毒［3]，在无菌条件下切成0.3 cm×0.3 cm大小的片段种植在PDA培养基里，置于(28±1)℃温箱中静止培养。培养3～12 d后，在接种点周围可见有菌丝生长，挑取植物组织周围的菌丝转接入PDA试管斜面，经纯化即得川乌植物内生真菌。　
       1.5  内生真菌的分类鉴定采用插片培养方法，对分离获得的内生真菌进行显微形态特征的观察、分类鉴定。分类检索参照文献［4，5］。
       1.6  内生真菌的抗菌活性筛选
       1.6.1  内生真菌的发酵培养将分离获得的内生真菌分别接入PDA液体培养基中，于(28±2）℃，200 r/min 的摇床上振荡培养6 d，加等体积的95%酒精浸提48 h以上，过滤弃菌丝体浓缩浸提液，制成菌株的发酵样品备用。
       1.6.2  指示菌的培养将待试的4株细菌接入营养肉汤液体培养基、2株真菌接入沙博弱氏斜面，置于（37±1)℃温箱培养待用。
       1.6.3  抗菌实验采用滤纸片法，在无菌状态下用无菌水洗下指示菌真菌的菌休制成菌悬液，供试细菌采用混皿、真菌采用涂皿的方法做成供试平皿（平均每皿加指示菌0.1～0.4 ml)，将蘸有内生真菌发酵提取浓缩物的无菌滤纸片轻放其上，置于(37±1）℃培养24～72 h，测量抑菌圈直径大小。
       
       2  结果
       2.1  滇南黄草乌内生真菌的分离从滇南黄草乌植物中分离获得内生真菌37株，根部15株，茎部22株，经分类鉴定共有12个属见表1。
       
       从表1可以看出，滇南黄草乌的内生真菌在根部和茎部的分布，无论是在种群和数量分布上，茎部分离的内生真菌略显著于根部，并且其种群组成基本不同(除无孢类群 Mycelia Sterelia 外)，根部是以毛壳菌属（Chaetomium)为优势属，有3株占根部内生真菌的20.00%，面茎部则以镰孢霉属(Fusarium)为优势属，有7株(占茎部的31.82%)。
       表1  滇南黄草乌植物内生真菌的分布（略）
       2.2  滇南黄草乌内生真菌的抗菌活性及活性菌株的分布在滇南黄草乌内生真菌活性菌株中，有14株内生真菌对1株或多株指示菌有拮抗作用(见表2)。
       表2  滇南黄草乌植物内生真菌的抗菌活性菌株及其分布（略）
       从表2可看出，滇南黄草乌内生真菌抗菌活性菌株主要分布在茎部，有12株占抗菌活性菌株的85.71%，根部只有2株占14.29%。
       
       在有抗菌活性的菌株的种群分布上，12株共分布在7个属(未包括无孢类群)，其中以镰孢霉属为优势属，有6株占抗菌活性菌株的42.86%，并且对皮肤致病菌(白假丝酵母Candida albicans 和星形石膏样毛癣菌 Trichophyton gypseum asteroides)的抗菌作用显著；而以青霉属(penicillium)抗菌素菌活性高及抗菌谱广，它对本次实验中的5株指示菌有拮抗作用且抗菌素菌活性高(抑菌圈直径≥15 mm)。
       3  讨论
       
       　　从以上实验结果看出，滇南黄草乌植物内生真菌中广泛存在有抗菌活性的菌株，并且抗菌活性和种群都有多样性特点。镰孢霉属不仅是滇南黄草乌植物的优势属种，而且也是茎部内生真菌的优势种，同时还是有抗菌活性菌株的优势属种，并且对皮肤致病菌有显著的拮抗作用。有待进一步研究。
       
       本次滇南黄草乌内生真菌的研究中，无论是在内生真菌的种群分布，还是有抗菌活性菌株的分布，茎部的明显多于根部，这可能与滇南黄草乌的毒性有关。
       
       分布在根部的1株青霉属的抗菌活性高且抗菌谱广，这可能与根部含乌头碱成分的种类及含量有关。
       
       近年来，不断有从各种内生真菌中发现新抗生素和抗肿瘤物质的报道。我们从滇南黄草乌中筛选有抗菌活性的菌株，并在今后的工作中进行有效活性成分的分离，不仅对保护滇南黄草乌植物资源、开发新型抗菌药物，还可以为解决多年来困扰临床的乌头碱的毒性问题寻找到一条新路子。
       
       致谢：云南会泽县大海乡中草药种植基地提供的植物样品，在此表示谢意。
       【参考文献】
         　　［1］ 李明福.滇中黄草乌资源开发及种植被技术［J］.安徽农业科学，2006，34（1）：11，14.
       
       ［2］ 符华林.我国乌头属药用植物的研究概况［J］.中药材，2004，27（2）：149.
       
       ［3］ 李治滢，杨丽源，周 斌，等.灯细辛内生真菌的研究 I:菌种分离及其分类鉴定［J］.云南大学学报，2003，25(1):65.
       
       ［4］ 魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：上海科学技术出版社，1979.
       
       ［5］ H.L巴尼特，B.B亨特著，沈崇尧译.半知菌属图解［M］.北京:科学出版社，1977.