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       【摘要】 
       目的围绕止血、抗炎消肿、抗菌等方面，进行复黄片的主要药效学研究。方法应用小鼠断尾止血和家兔凝血实验，建立大鼠角叉菜胶肛门肿胀和大鼠蛋清足跖肿胀模型，分别观察复黄片止血及抗炎消肿作用；采用试管法和平皿法评价复黄片体外抗菌作用。结果复黄片连续给药7 d，能明显缩短小鼠断尾出血时间、家兔凝血时间和凝血酶原时间，减轻大鼠肛周组织肿胀和足跖肿胀，对多种致病菌尤其是肠道菌具有明显的抑制作用。结论复黄片具有显著的凝血止血、消肿抗炎和抗菌药理作用。
       【关键词】  复黄片 痔疮 止血作用 抗炎 抗菌
       Study on Effects of Fuhuang Tablet in Hemostatie, Antiinflammation and Antiswelling, Antibacteria
       HAN Xianghui, LU Jingen, CAO Yongqing, AN Hongmei, HUA Yongqiang, YOU Shengfu
       (Scientific Research Center; Longhua Hospital Affiliated to Shang hai University of TCM, Shanghai 200032, China; Institute of Chinese Traditional Surgery, Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM, Shanghai 200032, China)
       Abstract:ObjectiveTo investigate the pharmacological actions of Fuhuang Tablet including hemostasis, anti-inflammation, anti-swelling, and antibacteria. MethodsThe hemostatic and thrombotic effects of Fuhuang Tablet were tested by severing tail and test-tube method, respectively; Carrageenan-induced perianal swelling in rats and albumen-induced hind paw edema in rats were prepared; the antibacterial activity in vitro was evaluated by tube two-fold dilution and plate method. ResultsFuhuang Tablet significantly shortened bleeding time in mice and coagulation time, prothrombin time in rabbits in a dose-dependent manner, obviously eliminated perianal swelling, greatly prevented rat hind paw edema, and effectively inhibited all of the pathogenic bacteria tested (especially intestinal pathogenic bacteria).ConclusionFuhuang Tablet showed significantly hemostastic, antibacterial, antiinflammatory, and antiswelling effects.
       Key words:Fuhuang Tablet;  Hemorrhoid;  Hemostasis;  Anti-inflammatory;  Antibacteria
       
       痔疮是临床常见的肛肠疾病之一，随着对痔疮病因、病理及机制研究的进展，人们逐渐认识到非手术治疗是治疗该疾病的首选方法。据统计约有80%的肛肠疾病患者会出现不同程度的便血，因此便血已成为肛肠疾病的第一大症状。上海中医药大学附属龙华医院研制的复黄片系中医外科权威顾伯华教授和陆金根教授几十年治疗便血为主痔疮疾患之经验处方，已在龙华医院使用了二十多年，经过上万例临床研究证实其总有效率达97.12 %［1］，目前作为中药六类新药开发并申报。本研究根据复黄片的功能主治和临床应用，并按照《新药审评办法》和《中药新药研究指南》要求［2］，从止血、抗炎消肿、抗菌等方面进行了主要药效学研究，为其开发和应用提供科学的实验依据。
       1  材料与仪器
       1.1  药品与试剂复黄片干浸膏粉，深褐色粉末，批号：061106，上海交通大学药学院上海联合实业集团有限公司提供，每克干膏粉相当于11.03 g生药；痔宁片，三九企业集团湖南南开制药厂生产，批号20060502；安络血，上海医药（集团）有限公司信谊制药总厂生产，批号060801；阿司匹林肠溶片，上海信谊百路达药业有限公司产品，批号：0654007；凝血酶原时间测定试剂盒Lot：010703A， ISI<1.3，天津美德太平洋科技有限公司生产；角叉菜胶，Sigma 公司产品，批号046k01，临用前生理盐水配制成10 g/L的溶液；乌拉坦，中国医药 (集团)上海化学试剂公司产品，批号：20030308，临用前以生理盐水配制成200 g/L的溶液；营养肉汤培养基，国药集团化学试剂有限公司产品，批号20061116；营养琼脂培养基，国药集团化学试剂有限公司产品，批号：F20061109。
       1.2  仪器PYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂；HH-W21-420型电热恒温水浴箱，上海跃进医疗器械厂；游标卡尺，上海量具刃具厂生产，测量范围0～155 mm，精确度为0.02 mm；800B型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；FA2004B型电子天平，上海精密科学仪器有限公司生产。
       1.3  动物昆明种小鼠， SPF级，体重18～22 g；SD大鼠，SPF级，体重200～250 g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证号SCXK（沪）2003-0003号；新西兰白兔，SPF级，体重2～2.5 kg, 购于上海宝牧实验动物养殖厂，动物合格证号SCXK（沪）2003-0007号；所有动物雌雄各半，饲养于上海中医药大学附属龙华医院实验动物中心。
       1.4  菌株金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003株、沙门氏菌CMCC(B)50094株、大肠杆菌CMCC(B)44102株、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501株、白色念珠菌CMCC(F)98001株购于上海东标药检器材有限公司，甲型溶血性链球菌、肺炎球菌、痢疾杆菌系临床分离株。
       2  方法
       2.1  止血实验
       2.1.1  出血时间的测定［3］昆明种小鼠60只适应性饲养1周后，按体重随机分为6组：空白对照组，给予0.9 % 生理盐水；复黄片低、中、高剂量组，分别给予复黄片干膏粉0.24，0.48，0.96 g·kg-1·d-1；痔宁片对照组，给药剂量为1.92 g·kg-1·d-1；安络血对照组，给药剂量为2.5 mg·kg-1·d-1；所有动物均灌胃给药（ig），给药体积为0.1 ml/g，1次/d，连续给药7 d，末次给药后1 h, 将小鼠置于特制的固定器中,于小鼠尾端1.5 cm处剪断, 开始计时，待血液自行流出, 用滤纸吸血, 吸时勿用力挤压断面，直至出血自然停止，记录出血时间。
       2.1.2  凝血时间的测定［4］取家兔40只适应性饲养1周后，随机均分为5组：空白对照组，ig 0.9% 生理盐水；复黄片低、中、高剂量组，ig复黄片干膏粉0.12，0.24，0.48 g·kg-1·d-1；痔宁片对照组，ig 痔宁片0.48 g·kg-1·d-1；给药体积为10 ml/kg，1次/d，连续给药7 d，末次给药后1 h, 自兔耳中央动脉采血1 ml，轻轻沿管壁放入内径8 mm，长10 mm的试管内。当血液吸进注射器即开始用秒表计时，每隔半分钟轻轻倾斜试管1次，角度约30°，观察血液是否流动，直至试管血液不再流动而完全凝固为止，停止计时，所历时间即为凝血时间，室内温度20℃。记录凝血时间并计算凝血时间缩短百分率。
       
       凝血时间缩短百分率（%）= (对照组平均凝血时间-给药组平均凝血时间)／对照组平均凝血时间×100 %
       2.1.3  血浆凝血酶原时间(PT)的测定［4］①血浆制备：末次给药后1 h, 用一次性真空采血针同时采血1.8 ml, 放入加有0.109 mol/L (3.2%)枸橼酸钠溶液0.2 ml的真空采血管中，颠倒混合8次，充分混匀后以3 000 r/min离心15 min，分离血浆。②PT试剂复溶：PT试剂恢复至室温后，按PT测定试剂盒说明书准确加入PT复溶液混匀，置37℃预温30 min。③凝血酶原时间测定：采用手工法测定各组动物PT值。取5个试管，每管分别加入兔血浆0.1 ml，37℃孵育3 min，加入已预温置37℃的PT试剂，混均后立即放入37℃水浴中温育，同时开动秒表，每隔2～3 s轻轻倾斜试管1次，至纤维蛋白凝固，液体停止流动或出现颗粒为止，立即停止计时，记录PT值（s）。取5管平均值作为凝血酶原时间最终测定结果。
       2.2  消肿抗炎实验
       2.2.1  角叉菜胶致大鼠肛周组织肿胀实验［5］取大鼠50只适应性饲养1周后，按体重随机分为5组：模型组，ig 0.9 % 生理盐水；复黄片低、中、高剂量组，ig复黄片干膏粉0.19，0.38，0.76 g·kg-1·d-1；痔宁片对照组，ig 痔宁片0.96 g·kg-1·d-1；给药体积为10 ml/kg，1次/d，连续给药7 d。其中在第3次给药后1 h, 乌拉坦ip麻醉(1.0 g/kg)，肛门内直肠粘膜下浆肌层注入1%角叉菜胶0.1 ml, 分别于6，24，48，72，96 h以游标卡尺测整个肛门周围组织肿胀的直径，取其长短两直径的均值，作为所测量肿胀程度的指标。
       2.2.2  蛋清所致大鼠足跖肿胀实验［4］取大鼠60只适应性饲养1周后，按体重随机分为6组：空白对照组，ig 0.9 % 生理盐水；复黄片低、中、高剂量组，ig复黄片干膏粉0.19，0.38，0.76 g·kg-1·d-1；痔宁片对照组，ig 痔宁片0.96 g·kg-1·d-1；阿司匹林对照组，ig阿司匹林100 mg·kg-1·d-1。给药体积为10 ml/kg，1次/d，连续给药7 d，注射蛋清当日先用游标卡尺测量每只大鼠右后足跖正常厚度，然后给药，末次给药1 h后, 以注射器先自右后足跖中部皮下注射蛋清0.05 ml/只致炎，然后用游标卡尺在相同部位分别测量各鼠致炎后0.5，1，2，4，6，24 h右足跖厚度，连续测两次，取其平均值判断足跖肿胀程度。比较给药组和空白对照组的肿胀差异程度，计算足跖肿胀度及肿胀抑制率。
       
       大鼠足跖肿胀度(mm)=致炎后足跖厚度(mm)-致炎前足跖厚度(mm)
       
       肿胀抑制率（%）=空白组足跖肿胀度均值-给药组足跖肿胀度均值空白组足跖肿胀度均值×100 %
       2.3  体外抑菌试验［2］
       2.3.1  试管法（肉汤稀释法）用蒸馏水分别配制复黄片和痔宁片溶液，实验浓度为 300 g/L，pH 7.0～7.2。8种实验菌株接种于营养肉汤液体培养基，37℃培养16～18 h，并用营养肉汤作1/1 000稀释。取无菌试管若干支，用液体培养基(葡萄糖酚红肉汤)等倍稀释药物后，各管加0.1 ml供试菌液，同时设药物对照管、培养基对照管和菌液对照管，37℃培养24 h后取出观察结果，在对照管符合要求的情况下，逐一观察各试验管，以仍然保持红色的试管的药物最高稀释度浓度判定为最低抑菌浓度(MIC)的终点。
       2.3.2  平皿法（琼脂稀释法）用蒸馏水分别配制复黄片和痔宁片溶液，实验浓度为220 g/L，然后用无菌生理盐水进行等倍稀释。取16个无菌平皿，分为复黄片组和痔宁片组，每组8个平皿，编号。1号平皿加入药液3 ml；2号平皿加入营养琼脂8 ml、药液2 ml，浓度为44 g/L；3号平皿加入未稀释的药液1 ml；4～8号平皿分别加入等倍稀释的药液1 ml，备用。然后向1和2号平皿内分别加入已熔化并冷却至40℃左右的牛肉膏汤琼脂培养基7 ml和8 ml，3～8号平皿内加入营养琼脂9 ml，立即摇动平皿，使培养基与药液充分混匀。待琼脂凝固后，制成含药平板培养基。用接种环（经过标定每环0.05 ml）分别蘸取各实验菌液以划线接种于每个含药平板的不同区域，每种药物、每种细菌做6个划线区域。接种好后放入37℃孵箱内培养24 h取出，观察不同细菌在不同浓度的药物平板上的生长情况。将含有≤3个菌落的琼脂平板中药物浓度定为最低抑菌浓度（MIC）。
       2.4  统计学处理除抗菌实验外，所有数据用±s表示，两组间比较均采用Student"s t test检验进行统计学分析。
       3  结果
       3.1  复黄片的止血及促凝血作用
       3.1.1  对小鼠断尾止血时间的影响给药7 d后，给药各组小鼠的止血时间与空白对照组比较均明显缩短，有显著性差异。其中复黄片低、中、高剂量组动物的止血时间较空白对照组分别降低21.0%，44.0%和52.3%（P<0.05或P<0.01），且复黄片随着给药剂量的增加，止血作用越强，具用明显的剂量依赖关系，表明复黄片对小鼠断尾出血具有明显的止血作用；痔宁片组和安络血组动物的止血时间较空白对照组分别降低38.1%和54.9%（P<0.01）。见表1。
       表1  复黄片对昆明小鼠断尾出血时间的影响（略）
       与空白组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；n=10
       3.1.2  对新西兰白兔凝血时间（CT）和血浆凝血酶原时间（PT）的影响给药7 d后，中、高剂量复黄片能明显缩短家兔的凝血时间，与空白对照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01），其凝血时间缩短百分率分别为28.63 %和33.99 %，表明复黄片有良好的促凝血作用；而复黄片低、中、高剂量组和痔宁片组家兔血浆PT测定值与对照组比较明显缩短（P<0.05或P<0.01），表明受试药能明显缩短家兔血浆凝血酶原时间，显示其止血作用还可能与影响外源性凝血系统有关，见表2。
       表2  复黄片对新西兰白兔凝血时间和凝血酶原时间的影响（略）
       与空白组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；n=8
       3.2  复黄片的消肿抗炎作用
       3.2.1  对角叉菜胶致大鼠肛周组织肿胀的影响各组动物肛门内直肠粘膜下浆肌层注入1%角叉菜胶后发生明显的肛周组织水肿，且均在注射后24 h时达到高峰，此时复黄片高剂量组动物肛周组织肿胀度明显低于模型对照组（P<0.01）；在注射角叉菜胶后48 h时，复黄片各剂量组和阳性对照药痔宁片对动物肛周组织水肿均有明显消除作用 (P<0.05或P<0.01)；在注射角叉菜胶后72 h时，复黄片仅有高剂量组和痔宁片组动物肛周组织水肿明显减轻(P<0.01)，表明复黄片连续给药7 d对角叉菜胶引起的大鼠实验性痔疮有明显的治疗作用，且作用可维持72 h以上。见表3。
       3.2.2  复黄片对蛋清所致大鼠足肿胀的影响各组动物足跖皮下注射新鲜蛋清后均发生明显的急性炎症水肿，空白对照组在注射蛋清后2 h时达最高值，然后开始下降。在致炎2 h时，复黄片低、中、高剂量组，痔宁片组和阿司匹林组动物足肿胀度与空白对照组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01），肿胀抑制率分别为23.90%，23.11%，31.37%，18.55%和26.70%。在致炎6 h时，复黄片低、中、高剂量组动物足肿胀抑制率分别为20.37%, 28.37%和57.44%，但仅高剂量组动物足肿胀度与空白对照组比较有显著性差异（P<0.01）；阿司匹林和痔宁片组动物足肿胀度分别比空白对照组降低29.46%和30.67%(P<0.05)。在致炎24 h时各组动物足跖炎症水肿明显消退，已降至正常值范围内。见表4。
       表3  复黄片对角叉菜胶所致大鼠肛周组织肿胀的影响（略）
       与模型组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；n=10
       表4  复黄片对蛋清所致大鼠足肿胀的影响（略）
       与空白对照组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；n=10
       3.3  复黄片体外抗菌作用试管法结果显示，复黄片和痔宁片在体外在一定浓度下对所试验的8种菌株都有不同程度的抗菌作用，其抗菌效果依次为：金黄色葡萄球菌＞沙门氏菌、大肠杆菌、白色念珠菌＞痢疾杆菌＞枯草芽孢杆菌、甲型溶血性链球菌、肺炎球菌。 复黄片MIC最低可达到0.59 mg/ml，而痔宁片的MIC最低为4.69 mg/ml，结果表明复黄片的抑菌效果优于痔宁片。见表5。
       表5  复黄片和痔宁片的体外抗菌作用（试管法）（略）
       平皿法结果显示，复黄片对所试验的8种菌株都有不同程度的抗菌作用，其抗菌效果依次为：甲型溶血性链球菌、肺炎球菌＞金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、白色念珠菌、痢疾杆菌＞枯草芽孢杆菌。其MIC最低可达到2.75 mg/ml；而痔宁片在最高浓度下仅对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌有一定的抑菌作用，在此方法下，复黄片的抗菌效果远优于痔宁片。见表6。
       表6  复黄片和痔宁片的体外抗菌作用（平皿法）（略）
       4  讨论
          
       痔疮临床表现为局部炎症、肿痛、便血、脱出等症状。复黄片作为治疗痔疮便血的有效、安全的制剂，其主要成分为蒲黄、大黄、地榆、槐角等,具有凉血止血、消肿止痛等功效，主治各种肛肠疾病出血之证，尤其适用于治疗各期内痔、肛裂、直肠息肉等以出血为主要临床症状之病证。方中蒲黄凉血止血，为君药；地榆和槐角为臣药；大黄为佐使药，有泻热凉血通便之效，荡涤肠胃，可收釜底抽薪之功。全方治以凉血止血，清热通便之法，主治血热妄行之便血，热既除而血自安，诸证悉愈［1］。
       
       止血包括血液凝固、血小板聚集和血管收缩3个重要因素。当外伤或疾病出血时可见受损局部血管收缩，血小板在血管破损处凝集，启动内源性及外源性凝血途径完成凝血过程，形成血块而止血［6］。为评价复黄片的止血作用，本研究以小鼠和家兔为实验对象，观察复黄片给药7 d后对小鼠断尾出血时间和家兔凝血时间及凝血酶原时间的影响。实验结果表明复黄片具有显著的止血和促凝血作用，作用机制可能与方中几种止血中药抑制破损伤口毛细血管通透性，参与内源性及外源性凝血途径有关。
       
       痔疮在药效学上没有固定的动物模型，根据《中药新药研究指南》的要求并参考相关文献，我们在动物的肛门部位模拟人的痔疮症状，采用角叉菜胶肛门内直肠粘膜下浆肌层局部注射建立大鼠肛周组织肿胀模型，观察复黄片的消肿作用。结果表明，复黄片对大鼠实验性痔疮模型有良好的治疗作用。另外本研究又采用实验性炎症模型（蛋清足肿胀模型）进行复黄片抗炎作用的考察。结果表明，复黄片中、高剂量对角叉菜胶引起的急性炎症有较好的抑制作用。
       
       两种体外抑菌实验表明复黄片对8种外科常见致病菌均有不同程度的抑制作用，尤其对金黄色葡萄球菌、沙门菌、大肠杆菌、白色念珠菌等肠道菌在较低的浓度即可抑制细菌的生长，其MIC（最低抑菌浓度）可达到0.59 mg/ml。由于复黄片作为中药制剂，水溶液的色泽较浓，会影响结果的判定，故用葡萄糖酚红肉汤代替普通肉汤，在此培养基中，细菌生长使葡萄糖发酵产酸，从而使酚红变为黄色，以仍保持红色的试管的药物最高稀释浓度判定MIC终点。复黄片水溶液用碳酸氢钠调节至中性（pH 7.0～7.2）以及去鞣酸后，对其抗菌作用无显著影响［7］。肉汤稀释法虽有方法简便，需要的时间短，不受药物制剂颜色或浑浊的影响等优点， 但不足之处是此法不够敏感，受细菌接种量的影响。因此我们同时采用平皿法，以全面客观地反映受试药物的体外抑菌作用。
       
       本研究结果表明，复黄片能减轻痔疮患部肿胀，其作用途径与其具有止血、抗炎、抗菌等药理作用有关，为临床应用于治疗便血为主的痔疮疾患提供了药理学依据。
       【参考文献】
         　　［1］ 潘一滨，曹永清，陆金根.复黄片治疗痔出血144例的随机双中心单盲临床试验［J］.中国新药与临床杂志,2005,24(8):643.
       
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       ［6］ 王 影,杨祥良,刘 宏,等.灯盏花素抗凝血作用的研究［J］.中药材,2003，26（9）: 656.
       
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