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       【摘要】 
       目的优选湖北贝母有效部位即总生物碱的最佳提取工艺。方法 采用正交实验设计，测定不同提取条件所得总生物碱的含量及收率，结合各实验样品药理效应强弱的评价，优选出湖北贝母有效部位的最佳提取工艺。结果当提取条件为以50％EtOH提取3次，1 h/次，4倍体积/次时，湖北贝母有效部位总生物碱的收率最高，其镇咳和平喘的综合药效最强，经过稳定性验证后，将该工艺确定为湖北贝母有效部位的最佳提取工艺。结论该研究以化学指标和药效指标相结合的方法来优选湖北贝母有效部位的最佳提取工艺，相对单纯化学指标来说更为科学和可信，可以有效防止以单纯化学指标优选出的工艺与药理效应不一致时的偏差，使优选出的工艺真正为活性导向下药材有效部位的最佳提取工艺。
       【关键词】  湖北贝母 正交设计 药效筛选 提取工艺
       Studies on the Extraction Process of Active Fraction from Bulbs of Fritillaria hupehensis
       XU Fangzhou ， CHEN Cang ， RUAN Hanli， ZHANG Yonghui， PI Huifang， WU Jizhou* 
       
       （Shenzhen Hospital of Beijing University，518036，China; Tongji Pharmacological School of Huazhong University of Science and Technology， Wuhan， 430030，China）
       Abstract：ObjectiveTo optimize the extraction process of the active fraction (the total alkaloids) from the Bulbs of Fritillariae hupehensis. MethodsApplying orthogonal design in this study， we got nine extraction samples of Bulbus Fritillariae hupehensis. And then we evaluated the optimum extraction process through assaying the total alkaloids yields of these samples and screening their antitussive, expectorant and antiasthmatic activities.ResultsWhen the extracting process was 1 hour, 3 times and 4 times volumes of the material powder with 50 % EtOH， the sample extract had the highest total alkaloids yields and strongest bioactivities. According to this study， we determined it as the optimum extraction process. ConclusionCombining chemistry and pharmacological indexes to optimize the extraction process of Bulbus Fritillariae hupehensis was more scientific than single chemistry index， the optimum extracting process was more credible and feasible.
       Key words： Bulbs of Fritillariae hupehensis;   Orthogonal design;   Pharmacodynamic screening;  Extraction process
       
       中药贝母为百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria L.)多种植物的干燥鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳和散结消肿的功效，在我国使用历史悠久，至今仍是防治呼吸系统疾病之要药。湖北贝母 Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C. Hsia原野生于湖北省恩施自治州，俗称“板贝”或“窑贝”，民间习作川贝药用，历史悠久，现已收载于《中国药典》2000版，发展为仅次于浙贝母的第二大主流品种。吴继洲教授等从1979年开始，对其作了化学成分、急性毒性、初步药效学和一般药理学等品质评价的系统研究，发现湖北贝母镇咳、祛痰及平喘的主要活性部位为总生物碱。对湖北贝母活性导向分离的研究中曾发现当提取溶媒为50％EtOH时，提取所得总生物碱部位镇咳、祛痰和平喘的药效为最好［1］。在确定此提取溶媒的基础上，为进一步优化湖北贝母有效部位的提取工艺，本研究采用正交实验设计，考察了提取时间、提取次数和溶媒体积3个因素，以各提取物总生物碱产率为化学指标，结合各样品镇咳、祛痰和平喘活性的强弱对湖北贝母有效部位的提取工艺进行优选，为湖北贝母的进一步开发利用提供参考依据。
       1  材料与仪器
       1.1  仪器RE52A 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂； UV754紫外可见分光光度计，上海分析仪器厂；METTER TOLEDO AG285型电子天平。
        
       1.2  试剂湖贝甲素对照品，本教研室吴继洲教授提供；各种化学试剂，国产分析纯。
       1.3  动物昆明种小鼠，雌雄兼用，体重（20±2）g；豚鼠，雌雄兼用，体重(170±20) g，均由本校实验动物中心提供。
       2  方法与结果
       2.1  总生物碱的含量测定采用酸性染料比色法［2，3］。
       2.1.1  标准曲线的制备 精密称取湖贝甲素对照品10.00 mg，置50 ml容量瓶中，用氯仿溶解并加至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别精密吸取该对照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml置25 ml容量瓶中，加邻苯二甲酸氢钾缓冲液(pH=4.5)5 ml，溴甲酚绿2 ml，再加氯仿至刻度，充分摇匀，移入分液漏斗中，静置10 min分层，取下层液于415 nm波长处测定吸光度。将吸光度与相应的浓度作回归处理，得回归方程为A=7.095-3+2.644X，r=0.999 6 (A为样品溶液吸光度值，X为样品含生物碱的毫克量)
       2.1.2   提取物中总生物碱含量的测定分别精密称取等量样品总生物碱浸膏适量，用氯仿溶解定容至50 ml，摇匀后分别精密吸取各样品液0.20 ml置于25 ml容量瓶中，加邻苯二甲酸氢钾缓冲液（pH=4.5）5 ml，溴甲酚绿指示剂2 ml，摇匀，加氯仿至刻度，按上述标准曲线下操作方法测定各样品的吸光度并计算各样品中生物碱的含量及产率。
        
       2.2  正交设计考察提取时间、提取次数和溶媒体积在以往湖北贝母总生物碱提取分离研究的基础上，本文选取提取时间，提取次数和溶媒体积（50％EtOH）为考察因素，各因素相应安排了3个水平， 选用L9(34)正交表安排实验。因素水平的安排见表1。
       
       将湖北贝母鳞茎研成粉末，过20目筛，分别称取该粉末80 g，按表1安排实验，回收并浓缩各提取液，经酸碱处理后，再以醋酸乙酯萃取，直至水层对Draggendorf"s试剂不显色，回收醋酸乙酯萃取液并浓缩成浸膏。将各实验样品所得浸膏转移入已干燥至恒重的蒸发皿中，在相同条件下于60 ℃烘箱中干燥2 h，取出，置干燥器中冷却30 min后立即称重，计算各样品浸膏得率，并进行生物碱含量测定，计算各样品总生物碱的收率(%)。实验结果及方差分析见表2～4。
       表1  L9(34) 因素水平设计（略）
       2.3  药理效应评价［4］由于提取所得的活性部位除生物碱外还含有非生物碱成分，这些成分对总生物碱药效的影响并不清楚，所以若单纯以化学指标如生物碱产率的高低来优选最佳提取工艺，其药效是否最强仍未可知，由此，对这些提取浸膏做了进一步的药效筛选。
       2.3.1  镇咳效应的筛选取体重(20±2) g小鼠，雌雄各半，随机分组（n=10），各组i.g给药1 h后，将小鼠置于倒置的500 ml烧杯内，用1 ml注射器吸取氨水0.15 ml注入烧杯内放的棉球中，观察小鼠的咳嗽潜伏期和3 min内咳嗽次数。
       2.3.2  祛痰效应的筛选 分别配制标准浓度酚红溶液，以分光光度计测定吸光度(A )，以A对酚红含量C 回归，得回归方程A= 2.490 9+ 0.053 722C，r=0.999 5。
       
       取体重(22±2) g雄性昆明种小鼠，随机分组(n=8)，各组i.g给药30 min后，再i.p给予5％酚红溶液0.01 ml/g，30 min后处死小鼠，仰位固定于手术台上，剪取自甲状软骨至气管分叉处的气管段，放入已盛有2 ml 0.5%的NaHCO3试管中，稳定洗出液的pH，以4 000 r/min离心20 min后测定吸收度。
       2.3.3  平喘效应的筛选取体重(170±20) g豚鼠（雌雄均可）逐一测定引喘潜伏期，挑选合格者。将其放入402AI型超声雾化器中，以53 kPa恒压喷入2％氯化乙酰胆碱和0.4%组胺的等量混合液15 s，密切注意豚鼠的反应，观察6 min内豚鼠出现喘息性抽搐的潜伏期即引喘潜伏期(从喷雾停止到出现喘息性抽搐的时间)。如见到豚鼠跌倒应立即取出，以免死亡，记录引喘潜伏期，若潜伏期大于150 s则认为不敏感而不予选用。
       
       次日将合格豚鼠随机分组(n=6)并i.g给药，30 min后以同样条件引喘并测定引喘潜伏期，计算给药前后各豚鼠引喘潜伏期的差值。
       3  讨论
       3.1  药理效应评价从表2药效实验筛选的结果可以看出，按正交设计提取得到的9个有效部位样品中，6，7，8，9四个样品的镇咳作用与阴性比较均显示出较强的镇咳活性，其中又以6号样品作用最强，其与阳性对照可待因的药效非常接近。祛痰活性的筛选中，9个样品与阴性比较均无明显的统计学差异，说明湖北贝母有效部位即总生物碱浸膏的祛痰效应总体来说不明显。在平喘活性的筛选实验中，9个样品中只有6号显示出了一定程度的平喘活性，其余8个样品平喘作用则均不明显。
       
       综合评价药效实验的筛选结果，9个有效部位提取样品中以6号样品的生物活性为最强。
       3.2  生物碱产率评价 表3正交实验设计的结果表明9个提取物样品中生物碱提取率最高的为6号(A2B3D2)；进一步的方差分析（见表4）表明， 在对湖北贝母有效部位的提取时间，提取次数和溶剂体积3个因素中，各因素均达不到影响显著性的程度，故仍然参考表3中的极差对正交结果进行分析。由极差分析可见，影响最大的因素为提取次数，其次为提取时间，最后则是溶媒体积，由此以生物碱提取率为指标得出最佳的提取工艺为A2B3D2。
       3.3  提取工艺的综合评价及稳定性验证综合生物碱提取率的高低和药理效应的筛选结果，6号工艺所得到的有效部位不但药理效应最强，而且总生物碱收率也最高。为考察该提取工艺的稳定性，本研究还分别按此工艺提取了3批样品，测定了各自总生物碱的含量，计算得出总生物碱的平均收率为0.510 2%，3次结果差异较小，说明该工艺稳定可行。由此确定湖北贝母有效部位的最佳提取工艺为以50％EtOH提取3次，1 h/次，提取溶媒体积为4倍/次。
       表2  药效实验筛选结果（略）
       阳性对照：镇咳为磷酸可待因；祛痰为愈创木酚甘油醚；平喘为氨茶碱
       
       阴性对照：0.02%Tween80生理盐水液
       
       与阴性对照组比较：*P<0.05  **P<0.01  ***P<0.001
       
       △：以吸光度衡量
       表3  正交实验设计及结果（略）
       表4  方差分析（略）
       本研究不仅在活性导向下以化学和药效双重指标得出了湖北贝母有效部位的最佳提取工艺，还从另一角度阐明了湖北贝母有效部位中总生物碱的含量高低与药效强弱是平行一致的，即生物碱含量越高其所对应的镇咳和平喘的活性也越强。
       
       正如中药的提取分离若在活性筛选的指导下进行，研究活动将变得更为有的放矢一样，在中药有效部位提取工艺的优化研究中，若能将化学指标和药效指标相结合，将使优选出的提取工艺依据更充分、可信和可行。本实验采用的活性和含量相结合的方法为中药提取工艺的优化提供了一种新的思路，值得尝试。
       【参考文献】
         　　［1］ 张勇慧， 阮汉利， 曾凡波， 等.湖北贝母镇咳、祛痰、平喘药效部位的筛选［J］. 中草药， 2003， 34(11): 1016.
       
       ［2］ 张 鹏，徐仿周，吴继洲.贝母及其复方制剂中生物碱含量测定方法［J］. 医药导报， 2004， 23 (4): 261.
       
       ［3］ 刘定远. 医药数理统计方法［M］. 北京：人民卫生出版社， 1999:254.
       
       ［4］ 徐叔云，卞如濂，陈 修. 药理实验方法学，第2版［M］. 北京：人民卫生出版社， 2002: 889，1359.