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       【摘要】 
       目的研究花椒挥发油抗宫颈癌Caski细胞作用及其可能的机制。方法花椒挥发油按不同时间（24, 48, 72 h）及不同浓度(0. 5～8 mg/ml)分别处理Caski细胞，MTS法分析细胞的增殖速度，用流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期。结果4 mg/ml花椒挥发油处理Caski细胞72h可显著地抑制Caski细胞增殖，1 mg/ml花椒挥发油处理Caski细胞72 h即可导致亚凋亡峰的出现，且G0/G1期细胞增多, S期和G2/M期细胞减少。 结论花椒挥发油可抑制Caski细胞增殖并诱导细胞凋亡。
       【关键词】  花椒 Caski细胞 细胞凋亡
       花椒不仅是深受民众喜爱的重要食用性香料，还是常用的中药材，其资源在我国分布很广，具有很高的安全性。花椒挥发油是花椒主要成分之一,其含量为1%～6%(产地不同含量也不同)。油中主要成分为棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等。国内外研究报道花椒对镇痛、镇静、抗炎、杀菌、抗病毒、抗真菌、抗氧化等均具有较强的药理学活性［1～4］。随着对花椒提纯和药理作用的深入研究,发现花椒还具有抗肿瘤作用，但目前对花椒抗肿瘤的研究还不够深入，其体内外的抗肿瘤机制仍不明了。为了认识花椒抗癌作用的机制和特点，我们选用宫颈癌Caski细胞为研究对象，观察了花椒对该细胞的抑制作用，以期探讨花椒抗肿瘤作用及其可能的机制。
       1   材料与仪器
          
       花椒，采于湖北省宜都县，经汪鋆植博士鉴定为Zanthoxylum bungeanum。Caski细胞由三峡大学分子生物学研究所提供；MTS细胞增殖分析试剂由Promega公司提供；其他化学试剂来自Sigma公司和华美公司；EPL CSXL流式细胞分析仪为Becman Coulter公司产品；全波长酶标仪为为Thermo公司产品；R206D旋转蒸发器为上海申生科技有限公司产品；超声破碎仪为北京君合华科技发展有限公司产品。
       2  方法
       2.1  花椒挥发油制备使用旋转蒸发器提取花椒挥发油并过滤除菌，称取适量挥发油加入5%Tween-80水溶液中，超声破碎仪处理10min，用RMPI 1640无血清培养基倍比稀释成8，4，2，1，0.5 mg/ml的浓度。
       2.2  Caski细胞培养Caski细胞接种于含10%小牛血清的RMPI 1640培养液,青霉素100 μg/ml,链霉素100 μg/ml。置于37℃，5% CO2培养箱中常规培养。
       2.3  细胞增殖分析将对数生长期的Caski细胞以4×107/L；细胞数接种于圆底96孔培养板,每孔50 μl。37℃培养24h后,向孔内直接加入含不同浓度花椒挥发油的RPMI 1640培养基50 μl。在加入药物后选定的时间点(24，48，72 h),向每孔中加入20 μl  MTS试剂,37℃继续保温2 h显色,于490 nm波长下读取OD值。
       
       细胞生存率（%）=OD药物/OD对照×100%；
       
       细胞生长抑制率（%）=(100-细胞生存率)×100%
       2.4  流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期取1×106对照细胞或经花椒挥发油处理的细胞,用冰冷PBS洗涤1次后,再悬浮于500 μl低渗DNA染色液中(1 g/L Sodium Citrate, 0.1%TritonX 100, 100 mg/L RNase, 50 mg/L Propidium Iodode), 4℃保温30min后,经流式细胞仪分析凋亡细胞及细胞周期时相分布，计算细胞增殖指数（PI）。
       
       PI（%）=（S+G2/M）/(G1+S+G2/M)×100%
       2.5  统计学处理　数据用±s表示，采用组间t检验进行统计分析。
       3  结果
       3.1  花椒挥发油抑制Caski细胞的增殖花椒挥发油对Caski细胞增殖呈明显抑制作用，且这种抑制随药物浓度加大和药物作用时间延长而增加（见图1）。花椒挥发油浓度为4 mg/ml时，24 h抑制率为20%, 48 h抑制率为46%, 72 h抑制率为78%。
       3.2  花椒挥发油诱导Caski细胞的程序性凋亡因发生凋亡的细胞核内,部分DNA发生片段化降解而丢失,经Propidium Iodode染色后, 这部分细胞核将出现在G1峰之前,即亚凋亡峰的位置。1 mg/ml花椒挥发油处理Caski细胞72 h即可导致亚凋亡峰的出现。所以花椒挥发油可诱导Caski细胞的程序性凋亡。
       3.3  花椒挥发油抑制Caski细胞周期的正常转换1 mg/ml花椒挥发油作用72 h后G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，作用具有明显的剂量依赖性（见图2），显示花椒挥发油可有效抑制细胞周期的正常转换,使细胞在G1期堆积，细胞阻滞于G2 /M期，从而阻止细胞的有丝分裂,使细胞增殖受到抑制。
       图1  花椒对宫颈癌Caski细胞生长的影响（略）
       图2  花椒作用72h对宫颈癌Caski细胞周期的影响（略）
       4  讨论
       
       　　前人研究表明传统中药可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤血管生成、逆转肿瘤细胞多药耐药和增强机体免疫力等多种机制发挥抗肿瘤作用［5～8］。本研究分析了花椒挥发油对宫颈癌Caski细胞的影响，我们发现，花椒挥发油可有效抑制Caski细胞周期的正常转换，从而阻止细胞的有丝分裂,抑制细胞生长，这种抑制随药物浓度加大和药物作用时间延长而增加；而且花椒挥发油可激发程序性细胞凋亡。因此，花椒至少可以通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡等方式发挥抗肿瘤作用。而进一步的体内实验，以及明确花椒挥发油中何种成分发挥作用，其详细的抗肿瘤机制等问题尚待深入研究。
       【参考文献】
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